大鼠脾切除對移植脂肪間充質干細胞的肝臟歸巢效率及肝硬化的影響

唐衛平，李 翀，陳國棟，趙 磊

(南華大學附屬第一醫院 1.肝膽胰外科；2.胃腸外科，湖南 衡陽 421001)

脾功能亢進是肝硬化門靜脈高壓癥的常見嚴重并發癥，可增加靜脈曲張破裂出血和肝硬化失代償風險[1]。脾切除術或脾動脈栓塞術常用于治療肝硬化繼發性脾功能亢進，能有效降低門靜脈壓力、增加血細胞計數、改善肝功能并促進肝再生[2]。近年來，干細胞移植療法作為肝硬化治療領域的前沿熱點被寄予厚望[3-4]。研究表明，間充質干細胞移植后能夠歸巢到損傷部位并通過替代受損細胞或者分泌細胞因子等方式促進組織再生，而脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)因易采集、增殖能力強以及抗感染等特征在組織重建和細胞移植應用方面廣受關注[5-6]，但脾臟切除對ADSCs的治療效果和歸巢效率的影響尚不明確。

本研究建立肝硬化大鼠模型，通過在干細胞移植前行脾切除手術，探討脾切除對ADSCs移植在治療肝硬化(抗肝纖維化、抑制肝損害、調節肝臟合成功能)以及增加肝臟歸巢效率的影響，闡明脾切除在ADSCs治療肝硬化脾亢中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級6周齡雄性SD大鼠40只，體質量180～220 g [南華大學醫學院實驗動物中心，動物許可證：SYXK(湘)2015-0001]。

1.1.2 試劑：Ⅳ型膠原酶、PBS和Accutase細胞消化液(Innovative Cell Technologies公司)；αMEM培養基、胎牛血清、軟骨誘導培養基、脂肪誘導培養基、阿爾新藍(Alcian Blue)、四氯化碳、橄欖油、油紅O(Oil Red O)、Qtracker 705 Cell Labeling Kit、引物collagen Ⅰ(上游5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，下游5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)；β-actin上游5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，下游5′-CAGGA AACAGCTATGACC-3′(Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(日本東洋紡公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs的分離、培養及鑒定：按以往建立的方法[7]分離培養ADSCs，行脂肪和軟骨誘導分化后分別行油紅O和Alcian Blue染色，細胞免疫熒光染色鑒定表面標志物。

1.2.2 Qtracker705納米粒子標記ADSCs示蹤：ADSCs接種24 h后，混勻各1 μL Qtracker A、B試劑，室溫孵育5 min，加入0.2 mL完全培養基混勻后添加到培養基中孵育60 min，洗滌后調整細胞數(1×106個/0.5 mL PBS)用于移植。

1.2.3 動物的處理及分組：四氯化碳與橄欖油按照1∶1體積比配制，按1 mg/kg劑量經腹腔注射，每周2次，持續8周，結束時隨機抽樣行肝組織病理學檢查證實肝硬化形成。肝硬化建模后，分別行脾切除術或假手術：異氟烷吸入聯合苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，沿腹中線做豎形切口，游離脾臟，結扎并離斷脾蒂，切除脾臟后關腹。假手術組腹壁切開，輕微翻動脾臟后關腹，術后繼續四氯化碳注射至實驗結束。

建模后隨機分4組，各組10只。假手術組(sham)：術后7 d 0.5 mL PBS經尾靜脈注入大鼠；假手術+ADSCs移植組(ADSCs)：術后7 d經尾靜脈注射Qtracker705標記的ADSCs；脾切除組(Sp)：脾切除術后7 d經尾靜脈注射0.5 mL PBS；脾切除+ADSCs移植組(Sp+ADSCs)：脾切除術后7 d經尾靜脈注射Qtracker705標記的ADSCs。

1.2.4 標本采集與檢測：移植7 d后收集肝組織標本和血清。1)肝組織石蠟包埋后切片行HE和Masson trichrome染色，鏡下隨機選取含門靜脈區的視野，用image J和Photoshop軟件計算肝纖維化面積比率。2)RT-PCR測定collagen Ⅰ mRNA表達：collagen Ⅰ和β-actin擴增程序:95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，Tm 60 s，72 ℃ 60 s(30個循環)，72 ℃ 10 min，瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下采集圖像并量化分析吸光度值，以collagen Ⅰ吸光度值與β-actin吸光度值的比值為校正值用于比較分析。3)收集大鼠血清以全自動生化分析儀測定谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和白蛋白(albumin,ALB)水平。4)收集各器官行冰凍切片及DAPI染色，倒置熒光顯微鏡觀察Qtracker705染色細胞的數量并觀察ADSCs在各器官的分布。5)熒光成像系統IVIS監測ADSCs在肝內的分布。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ADSCs生物學特征的鑒定

細胞經傳代后呈紡錘形(圖1A)，第3代細胞經脂肪誘導分化7 d后油紅O染色細胞內脂滴呈紅色(圖1B)，經軟骨誘導分化14 d后Alcian Blue染色陽性(圖1C)。間充質干細胞標志物CD29陽性，而血細胞和血管內皮細胞共同標志物CD45陰性(圖1D)。所采集的細胞符合ADSCs生物學特征。

A.ADSCs morphology:B.ADSCs differentiated into adipocytes as indicated by Oil Red O staining;C.under chondrogenic induction,ADSCs produced proteoglycans as indicated by Alcian Blue staining;D.immuno-fluorescence staining showed that cell surface marker was CD29 positive and CD45 negative圖1 ADSCs的生物學特征鑒定Fig 1 Biological characteristics of ADSCs

2.2 脾切除提高ADSCs對肝硬化的療效

sham組肝組織出現明顯肝細胞壞死、空泡化、炎性細胞浸潤和假小葉形成等肝硬化病理特征(圖2A)。ADSCs組肝纖維化面積較sham組明顯縮小(圖2B)，并且Sp+ADSCs組的纖維化面積明顯小于ADSCs組。與sham組對比，ADSCs組肝組織collagen I mRNA表達水平明顯下調(P<0.05)，而Sp+ADSCs組肝組織的collagen I mRNA表達水平相較于ADSCs組進一步降低(圖2C)。

在改善肝臟合成功能方面(圖2D)，ADSCs組大鼠血清白蛋白高于sham組(P<0.05)。在抑制肝損害方面(圖2E)，Sp+ADSCs組ALT低于ADSCs組和sham組(P<0.05)。

2.3 脾切除提高ADSCs的肝臟歸巢效率

ADSCs移植7 d后，在脾、肺和肝內均可發現Qtracker705標記的ADSCs(紅色)(圖3A)，且Sp+ADSCs組肝組織中的ADSCs數量明顯多于ADSCs組(P<0.05)(圖3B)，體外熒光成像結果顯示Sp+ADSCs組肝組織中熒光信號強度明顯高于ADSCs組(P<0.05)(圖3C,D)。

3 討論

對于肝硬化門脈高壓癥，脾功能亢進會導致肝硬化加重[8]，脾切除有利于肝再生并減輕肝纖維化[9]。但脾切除術后肝硬化患者的長期生存率仍有待提高[10]。近年來，使用干細胞移植治療疾病的臨床試驗越來越多[11]。雖然有報告表明，在造血干細胞移植前行脾切除術可提升干細胞在脾亢小鼠骨髓中的定植率[12]，但在肝硬化模型中，脾切除術對ADSCs治療的影響不明。本研究使用肝硬化大鼠模型來明確在干細胞移植前行脾切除能否提高ADSCs的肝內歸巢效率和療效，通過對肝纖維化、肝損害、肝臟合成功能以及肝臟歸巢效率進行對比分析，結果提示干細胞移植前行脾切除既增加了ADSCs的肝內歸巢效率，又增強了ADSCs對肝硬化的療效。

A.pathological changes in liver tissue;B.quantitative analysis of fibrosis by Masson trichrome staining;C.RT-qPCR analysis of collagen I in liver tissue;Serum ALB (D)and ALT (E)levels in each group;*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with ADSCs or Sp group

有研究提示脾切除減少了移植細胞受困于脾臟而提升了干細胞的療效[13]。在本研究中，與單純ADSCs移植相比，ADSCs移植前行脾切除顯著增加了ADSCs在肝內的定植數量，提高了歸巢效率，從而更有效減輕了肝損害并縮小肝纖維化面積。雖然脾切除未能提高肝臟的蛋白合成功能，綜合考慮為脾切除術后短期內蛋白大量丟失所導致蛋白水平低下的可能性大。

需要表明的是，本研究也存在不足之處，盡管脾切除提高了ADSCs的歸巢和對肝硬化的療效，但脾切術后可能導致免疫功能下降、炎性因子及肝再生相關因子表達改變[14]，這些因素對于干細胞本身、肝再生以及肝纖維化關鍵因素肝星狀細胞活化的影響在本研究中尚未涉及。因此，在將來的臨床實踐中，在干細胞移植前行脾切除術需充分權衡脾切除手術風險和提高干細胞療效兩者之間的利弊。

本研究通過在抗肝纖維化、抑制肝損害、調節肝臟合成功能以及增加肝臟歸巢效率這4方面進行對比分析，揭示了肝內歸巢效率與ADSCs療效之間的正向聯系，而脾臟的缺失則有助于更多的ADSCs進入肝內發揮作用，為脾切除術提高ADSCs對肝硬化的療效和歸巢效率提供了理論依據，并提示脾切除術可作為干細胞移植治療肝硬化脾亢的先決條件。

A.distribution of Qtracker705-labeled ADSCs in various organs;B.comparative analysis of ADSCs homing efficiency in liver tissue;Abbreviation:FOV,Field of view;C.ADSC engraftment monitored by ex vivo fluorescence imaging;D.quantitative analysis of fluorescence intensity of qtracker labeled ADSCs in liver;*P<0.05 compared with ADSCs group