羥基紅花黃色素A抑制人肝癌細胞系Huh7發生上皮-間質轉化

吳 娜，王 東，李京敏，白咸勇

(濱州醫學院 基礎醫學院 組織學與胚胎學教研室，山東 煙臺 264003)

根據2018年最新統計，肝癌是世界范圍內常見癌之一，也是癌相關死亡的第四大原因[1]。雖然肝癌的診斷技術和治療方法取得很大進步，但是5年生存率仍然很低。因此，尋找有效無毒的方案對治療肝癌迫在眉睫。在大多數肝癌患者中發現TGF-β 表達升高，并與其受體相互作用，激活細胞內TGF-β信號通路[2]。在腫瘤細胞中激活該通路可誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，上皮細胞失去底側極性和細胞間黏附功能，出現間充質細胞的運動特征，使大量腫瘤細胞具備轉移和侵襲的能力[3]。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)是從紅花中提取的單查爾酮類結構化合物[4]。HSYA主要通過抑制血管生成，對肝癌和胃癌有直接的抗腫瘤作用[5]。本研究將通過體內體外實驗研究 HSYA 對肝癌細胞遷移與侵襲的影響，從而為治療肝癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級裸小鼠，5周齡，雄性，12只，體質量18～22 g[濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SCXK(魯)20190003]；人肝癌細胞系Huh7(成都飛歐爾生物科技有限公司)；羥基紅花黃色素A(上海源葉生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMEM 高糖培養基(HyClone公司)；山羊血清工作液、免疫組化試劑盒(兔二步法)、DAB 顯色試劑盒和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG (二抗)(北京中杉金橋生物技術有限公司);兔抗 TGF-β1 單克隆抗體(中國Proteintech 公司)、兔抗vimentin和 E-Cadherin單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；ECL發光液(上海諾倫生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：將人肝癌Huh7細胞培養于含10% FBS的DMEM培養基中，取對數增殖期細胞用于實驗。對照組加入不含HSYA的培養基；實驗組加入不同濃度的HSYA(80和160 μmol/L)處理。

1.2.2 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：Huh7細胞以1×106/孔鋪滿6孔板，培養過夜后，用200 μL的槍頭垂直于預先在6孔板底部畫好的黑線劃線。無菌PBS沖洗劃掉的細胞，拍照并記錄(記為0 h)。對照組和實驗組細胞繼續培養12和24 h，拍照并記錄。用 ImageJ 軟件測量劃痕面積，計算傷口愈合百分比。傷口愈合百分比=(最初面積-某時間點的面積)/最初面積。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞侵襲：培養Huh7細胞過夜后，加入0、80和160 μmol/L HSYA干預24 h后。胰蛋白酶消化離心，無血清培養基吹打混勻，以每孔1×105個細胞，置于預先鋪有matrigel 膠的transwell小室內。在小室中加入200 μL細胞懸液，24孔板中加入含10% FBS的高糖DMEM培養基600 μL。37 ℃ 培養箱中培養12 h。取出小室，傾去培養基，PBS清洗2遍。4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗2遍。結晶紫染色20 min，PBS清洗2遍。晾干后在倒置顯微鏡下(×200)隨機觀察 5 個視野。利用Image J軟件統計細胞個數。

1.2.4 Western blot檢測TGF-β1、vimentin和E-Cadherin蛋白表達：HSYA作用24 h后，加入含1% PMSF的RIPA裂解液，6孔板以每孔100 μL的裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心20 min；取上清按照BCA試劑盒說明書測蛋白濃度；95 ℃加熱蛋白10 min后-20 ℃保存；取蛋白每孔20 μg上樣，進行 10% SDS-PAGE蛋白電泳，電泳完后，濕轉法將蛋白轉移到 PVDF 膜上；5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，根據分子質量的大小剪膜，加入兔抗GAPDH、E-cadherin、vimentin和TGF-β1單克隆抗體作為一抗4 ℃孵育過夜。第2天，將條帶拿出室溫孵育30 min后；TBST清洗4次，每次10 min；加入H&L羊抗兔 IgG二抗室溫孵育1 h；TBST清洗4次，每次10 min；加入ECL發光液在凝膠成像儀下顯影；利用Image J軟件分析條帶吸光度值。蛋白相對表達 =目的蛋白吸光度值 /內參蛋白吸光度值 ×100%。

1.2.5 動物的分組及處理：將Huh7細胞傳代培養，以1×107個/100 μL接種于裸鼠腋窩中部外側皮下，接種成功后，隨機分成2組，移植組和HSYA實驗組。根據本課題組之前的研究[6]，2.25 mg/kg HSYA是最佳治療劑量，接下來以2.25 mg/kg HSYA為實驗組。1周左右成瘤后，開始腹腔注射0.9%氯化鈉溶液和HSYA，每天1次連續14 d。給藥劑量按每1 g裸小鼠體質量注射10 μL。第15天處死裸鼠，進行取材固定。

1.2.6 HE和免疫組化染色：取裸鼠的肝臟和腫瘤(厚度4 μm)固定、脫水、包埋、切片。常規HE染色，倒置顯微鏡下觀察組織形態。免疫組化染色參照說明書進行操作，微波修復抗原，過氧化物酶阻斷劑阻斷過氧化物酶，山羊血清封閉非特異性抗原，一抗E-cadherin(1∶400)、vimentin(1∶200)和TGF-β1(1∶200)孵育4 ℃過夜，DAB顯色，倒置顯微鏡下觀察組織陽性表達結果并拍照。利用Image-pro plus 6.0軟件分析免疫組化圖片，統計移植瘤組織中棕黃色陽性表達結果的累積吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HSYA抑制人肝癌Huh7細胞的遷移和侵襲能力

與對照組相比，80和160 μmol/L的HSYA實驗組明顯減少Huh7細胞的侵襲數量(P<0.05)(圖1A)。隨著時間延長，HSYA作用Huh7細胞12和24 h后，細胞遷移的數量明顯少于對照組(P<0.05)(圖1B)。

A.HSYA inhibited the invasion of Huh7 cells,scale bar=100 μm；B.HSYA inhibited the migration of Huh7 cells,scale bar=500 μm;*P<0.05 compared with control group

2.2 HSYA對人肝癌Huh7細胞vimentin和E-cadherin蛋白表達的影響

HSYA實驗組vimentin表達量低于對照組，而E-cadherin表達量高于對照組(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group圖2 HSYA對Huh7細胞中vimentin、E-cadherin蛋白表達的影響Fig 2 Effect of HSYA on expression of vimentin and E-cadherin in Huh7 n=3)

2.3 HSYA抑制人肝癌Huh7細胞在裸鼠肝內轉移

移植組裸鼠肝臟中出現肝癌細胞轉移和侵襲(P<0.05)(圖3A，B)。移植組出現細胞核深染，肝細胞灶狀壞死，腫瘤細胞浸潤(如黑色箭頭)。HSYA實驗組無腫瘤細胞侵襲，肝小葉排列整齊。同時，移植組腫瘤細胞呈團狀分布，組織結構清楚，少量壞死腫瘤細胞；HSYA實驗組出現細胞核固縮，深染，灶狀壞死灶(如黑色箭頭)(圖3C)。

A.appearance of liver and morphological changes of liver cancer,sacle bar=100 μm;B.puncta of tumor cell metastases;C.morphological changes of tumor tissue,scale bar=50 μm;*P<0.05 compared with control group

2.4 HSYA對移植瘤TGF-β1、vimentin和E-cadherin蛋白表達的影響

E-cadherin、vimentin和TGF-β1陽性表達分布在細胞質中，呈棕黃色。與移植組相比，HSYA實驗組E-cadherin陽性表達升高，vimentin和TGF-β1表達降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group圖4 Vimentin、E-cadherin和TGF-β1在移植瘤組織中的蛋白表達Fig 4 Detection of vimentin,E-cadherin and TGF-β1 protein expression in the transplanted tumor tissues by immunohistochemistry(×400)

3 討論

TGF-β1作為TGF家族主要成員之一，在控制胚胎發育、炎性反應和組織修復以及維持人體組織內穩態方面發揮著關鍵作用[7]。此外，TGF-β 能夠通過Smad或非Smad信號通路誘導EMT。EMT的發生伴隨3個生物標志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin不同程度的變化。這些變化可導致細胞間黏附減少、極性喪失，從而促進腫瘤血管的生成、轉移和侵襲[2]。本課題組前期研究證實HSYA抑制H22昆明小鼠肝癌皮下移植瘤組織的血管生成；通過PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌細胞的增殖及遷移，并與PI3K抑制劑聯合使用增強腫瘤細胞的凋亡[6,8]。本研究采用細胞劃痕和Transwell小室法證明，HSYA能夠抑制人肝癌Huh7細胞的遷移和侵襲；同時采用免疫印跡實驗結果顯示，HSYA干預人肝癌Huh7細胞后E-cadherin表達量增加，vimentin表達量下降，表明HSYA能夠抑制肝癌細胞發生EMT。動物實驗發現，與移植組相比，HSYA抑制裸鼠皮下移植肝癌細胞轉移至肝內，HSYA實驗組TGF-β1和vimentin表達降低，而E-cadherin表達升高，表明HSYA抑制了移植瘤細胞發生EMT。

TGF-β1 在腫瘤的發生發展中扮演雙重作用[9]，早期通過免疫監視抑制腫瘤的發生。在腫瘤發生后促進腫瘤細胞遷移和侵襲，主要機制是TGF-β1能夠誘導EMT，下調E-cadherin 及上皮其他基因和上調vimentin及其他間皮細胞的表達，從而增強細胞的遷移和侵襲能力。結合本研究結果，HSYA干預后，體外培養的人肝癌Huh7細胞發生遷移及侵襲的細胞數量減少；皮下移植瘤細胞未發生肝內轉移；TGF-β1和vimentin表達降低，而E-cadherin表達升高。表明HSYA能夠通過抑制肝癌細胞發生EMT，從而抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。在此研究基礎上，本課題組將深入探究TGF-β 信號通路抑制肝癌侵襲和遷移的作用機制，為今后HSYA應用于臨床肝癌治療提供實驗依據。