降低脂筏內integrin β1減輕HPS大鼠血清誘導PMVECs增殖和遷移

高 靜，周家奇

(1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院 麻醉科，浙江 杭州 310000；2.浙江大學醫學院第一附屬醫院重癥醫學科，浙江 杭州 310000)

肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎上出現肺內微血管異常擴張(intrapulmonary vascular dilation,IPVD)、血管新生而導致的氧合異常綜合征，也是引起圍術期移植肝無功能及肺部感染的主要原因[1-3]。既往研究認為肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的異常增殖、遷移引起肺血管重塑在其中發揮了重要作用[4-5]。本課題組前期研究發現脂筏(lipid raft)在血管內皮細胞異常增殖和遷移過程中發揮了重要重用，但其確切機制不清。本研究發現脂筏內integrin β1通過激活integrin β1/FAK通路進而促進細胞增殖、遷移和血管內皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，可能介導了肝肺綜合征的肺血管重塑過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠及細胞：雄性SD大鼠(SPF級，250～300 g/只，浙江省醫學科學院動物中心)；原代大鼠肺微血管內皮細胞(Cell Biologics公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒：CCK-8試劑、甲基-β-環糊精(MβCD)(Sigma-Aldrich公司)；ECM培養基(Science Cell公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；DMSO(國產分析純)、VEGF-ELISA試劑盒(依科賽公司)，青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術有限公司)，HRP標記山羊抗小鼠二抗、HRP標記兔抗山羊二抗、抗 FAK 鼠單克隆抗體和抗 pY397FAK 兔單克隆抗體(北京康為生物科技有限公司)，EntransterTM-R(北京英格恩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPS大鼠血清的制備：腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (0.1 mL/100 g)麻醉，沿腹正中進腹，暴露并充分游離膽總管，分別在近肝門處和近十二指腸處結扎并剪斷，關腹[4]。建模后4周在無菌操作下抽取腹主動脈血，4 ℃離心取上清，56 ℃加熱30 min以滅活補體，-80 ℃保存。

1.2.2 細胞的分組及處理：將PMVECs分為：1)對照組：10%健康大鼠血清刺激組；2)HPS組：10%肝肺綜合征大鼠血清刺激組；3)MβCD組：事先用0.01 mol/L MβCD預處理細胞1 h；4)si-integrin β1敲低組：利用siRNA技術轉染靶向敲低integrin β1基因。體外合成特異性 integrin β1 siRNA，轉染前1天將1×106個PMVECs接種于100 mm培養皿，加入10 mL全培養基。取1個離心管加入20 μg RNA，然后加入無血清 DMEM 充分混勻，制成250 μL的RNA 稀釋液，另取1個離心管，加入EntransterTM-R 60 μL，然后加入190 μL無血清DMEM，充分混勻，制成 250 μL的EntransterTM-R稀釋液，室溫靜置5 min。將EntransterTM-R稀釋液加入到RNA稀釋液，立即充分混勻。轉染后6 h觀察細胞狀態。培養24 h后檢測mRNA水平，48 h后檢測蛋白表達水平評價siRNA轉染后integrin β1的沉默效率。后3組用10%肝肺綜合征大鼠血清的ECM培養基培養。孵育48 h，進行后續實驗。

1.2.3 脂筏提取：采用密度梯度離心分離法提取脂筏。收集細胞，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，配置密度梯度，調節細胞裂解物至40% OptiPrep，密封在含有30%和10%的OptiPrep提取緩沖液中，可見明顯分層，然后4 ℃，35 000×g離心16 h，片段由等體積的去污劑不溶性富含糖脂復合體(detergent insoluble glycolipid rich complex,DIG)和非等體積的DIG組成，收集非DIG，免疫印跡檢測，顯影目標蛋白條帶。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達：收集細胞，加入改進RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min，取上清并測定其濃度后，SDS-PAGE分離轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，含0.05% Tween TBS洗膜5 min×3次，二抗孵育2 h，TBS液洗膜3次，化學發光劑于暗室中顯影并感光，圖像定量分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖：1)細胞接種：96孔板中均勻接種100 μL細胞懸液。放培養箱預培養24 h(37 ℃，5% CO2)。2)處理：向孔板中加入10 μL不同的待測物質，將培養板在培養箱孵育24、48 h。3)加CCK溶液：向孔板中加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育1～4 h。4)用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 細胞遷移的測定：將蓋玻片置于6孔培養板中，接種傳代培養PMVECs，細胞匯合后，取出蓋玻片，顯微鏡下用無菌細胞刮刀將蓋玻片上的細胞沿直線刮除一側，放入培養板，繼續培養24、48 h，顯微鏡下觀察細胞遷移情況，以測定遷移最遠的PMVECs至刮線邊緣的距離為細胞的遷移距離。每組觀察16個蓋玻片的細胞遷移距離，取均值。

1.2.7 測定上清VEGF濃度：以ELISA檢測各組VEGF濃度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肝肺綜合征血清刺激integrin β1脂筏聚集

脂筏區域(raft)：與對照組比較，HPS組脂筏內的integrin β1表達顯著增加(P<0.05)；而在給予脂筏解離劑MβCD后，對照組和HPS組脂筏內的integrin β1表達顯著降低(P<0.05)；非脂筏區域(non-raft)：與對照組比較，HPS組脂筏外integrin β1表達有所減少(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HPS group圖1 肝肺綜合征大鼠血清對細胞脂筏內外integrin β1表達的影響Fig 1 Effect of HPS rat serum on integrin β1 inside and outside lipid

2.2 脂筏內integrin β1表達上調促進FAK磷酸化

與對照組相比，HPS組pY397FAK磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組pY397FAK磷酸化水平受到顯著抑制(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖2 脂筏內integrin β1聚集對細胞FAK活性變化的影響Fig 2 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the activity of FAK among different groups

2.3 脂筏內integrin β1表達上調促進了肝肺綜合征血清誘導的細胞增殖

與對照組相比，HPS組細胞增殖能力在24和48 h時增強(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細胞增殖能力在24和48 h時顯著減弱(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖3 脂筏內integrin β1聚集對細胞增殖的影響Fig 3 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell proliferation among different

2.4 脂筏內integrin β1表達上調促進了肝肺綜合征血清誘導的細胞遷移

與對照組相比，HPS組細胞遷移距離在24和48 h時增強(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細胞遷移距離在24和48 h時顯著減弱(P<0.05)(圖4)。

arrow shows cell migration distance;*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖4 脂筏內integrin β1聚集對細胞遷移的影響Fig 4 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell migration among different

2.5 脂筏內integrin β1表達上調促進了肝肺綜合征血清誘導VEGF表達

與對照組相比，HPS組細胞VEGF分泌水平在24和48 h時增強(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細胞VEGF分泌水平在24和48 h時顯著減弱(P<0.05)(表1)。

表1 脂筏內integrin β1聚集對細胞VEGF表達的影響Table 1 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the expression of VEGF among different

3 討論

盡管HPS的研究逐漸成為研究熱點，但是臨床上仍缺乏有效的防治手段，對HPS分子機制的深入研究可為HPS的防治提供有效途徑[1，6]。目前的研究認為HPS的病理過程為原發肝病-肺微血管重塑-低氧血癥三聯征，其中以肺微血管重塑為主要病理改變[7]。前期研究發現PMVECs 的異常增殖、遷移可能發揮了作用，但確切機制尚待進一步研究[8-9]。

Integrin β1主要介導細胞與胞外基質間的連接，并影響胞外信號向胞內的傳遞；在細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學過程中發揮重要的調控作用[10-12]。脂筏是細胞膜上富含鞘磷脂和膽固醇的液態微區，大量的蛋白和脂類分子富集于此，成為膜動態變化和細胞信號傳導的平臺。早期的研究認為integrin并不定位在脂筏上，但近年的研究發現，integrin不僅能定位在脂筏區域，而且其功能的發揮還受到脂筏影響[12]。本研究發現：與對照組比較，HPS組脂筏內的integrin β1表達上調；用MβCD擾亂脂筏結構，可以有效阻止脂筏內integrin β1的表達，表明脂筏內integrin β1的表達依賴于脂筏結構的完整性。

黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，是細胞內多條信號傳導途徑的交匯點，激活下游多條信號傳導途徑[13-14]。HPS患者肝臟解毒功能下降，有害代謝產物，在細胞炎性因子等刺激下，胞質中的FAK可靶向到細胞膜，并定位到脂筏內，活化的FAK進而激活Ras-MAPK、PI3K和STAT等多條信號傳導通路[15]。本研究發現：與對照組比較，HPS組FAK活化水平顯著增高，細胞增殖、遷移和VEGF分泌顯著增加；而在給予脂筏解離劑MβCD或小干擾RNA敲低integrin β1表達后，FAK活化水平受到顯著抑制，細胞增殖、遷移和VEGF分泌顯著降低，表明肝肺綜合征血清通過誘導脂筏內integrin β1表達上調，進而增加pY397FAK活化水平，促進細胞增殖、遷移和VEGF分泌。

總之，本研究發現脂筏內integrin β1表達上調通過激活 integrin β1/FAK通路進而促進細胞增殖、遷移和VEGF分泌，可能介導了肝肺綜合征的肺微血管重塑，有望成為臨床治療的潛在靶點。