基于RNA-seq分析順鉑下調(diào)DRG神經(jīng)元軸突導(dǎo)向相關(guān)基因的表達(dá)

徐先林，宋思遠(yuǎn)，余春波，陸紅玲，卓 銘

(遵義醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

順鉑(cisplatin)是常用的化療藥物，但由于耐藥和嚴(yán)重的毒副作用導(dǎo)致順鉑的應(yīng)用在很大程度上受到限制[1]。周圍神經(jīng)損傷是鉑類藥物較常見的副作用[2]。目前關(guān)于順鉑神經(jīng)毒性機制研究僅局限在DNA損傷及線粒體功能障礙[1]，因此還有待進(jìn)一步探討。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)回路的形成是神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的基礎(chǔ)，神經(jīng)回路發(fā)育異?？赡軐?dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙或者神經(jīng)退行性疾病發(fā)生[3]。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)是鉑類藥物主要損傷靶點，順鉑暴露患者常出現(xiàn)感覺異常和麻木[4]，這可能與DRG神經(jīng)元軸突發(fā)育及神經(jīng)回路形成異常有關(guān)。DRG神經(jīng)元是收集外周感覺神經(jīng)并傳向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中轉(zhuǎn)站，需要高度活躍的轉(zhuǎn)錄來支持其快速的新陳代謝和軸突延伸[1]。軸突引導(dǎo)分子和受體是神經(jīng)回路形成的關(guān)鍵因素，它們是軸突導(dǎo)向相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物，通過局部翻譯或轉(zhuǎn)錄控制著軸突基因表達(dá)[5]。軸突導(dǎo)向相關(guān)基因的異常表達(dá)或突變可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[5]。

本實驗擬通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析順鉑對DRG神經(jīng)元軸突導(dǎo)向相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探討順鉑致DRG神經(jīng)元損傷的可能機制，為緩解順鉑神經(jīng)元損傷提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 動物：SPF級昆明小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量25～30 g[重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCxK(渝)2018-0003]。動物實驗遵循遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會要求。

1.1.2 主要試劑：順鉑、鼠抗NF-200抗體、膠原酶Ⅰ、多聚鳥氨酸和層黏蛋白(Sigma-Aldrich公司)；山羊抗鼠二抗、RNA提取試劑盒(Invitrogen 公司)；胰蛋白酶、血清、DMEM/F12(Gibco公司)；DNase Ⅰ(Roche 公司)；NGF(Millipore 公司)，DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)、青霉素/鏈霉素雙抗(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)及分組：取1～2月齡昆明小鼠，乙醚麻醉后處死，摘取DRG神經(jīng)元置于含胰蛋白酶(1 mg/mL)、膠原酶(1 mg/mL)的消化液中37 ℃消化1.5 h，1 000 r/min離心3 min后棄上清液，加入0.2 mg/mL的DNase Ⅰ 溫柔吹打20次后加入DPBS液至15 mL，緩慢吹打數(shù)次，采用70 μm細(xì)胞濾器過濾后離心，棄去上清液，加入含NGF(10 ng/mL)的完全培養(yǎng)基溫柔吹打混勻，接種于層黏蛋白和多聚鳥氨酸預(yù)處理過的24孔板中，細(xì)胞數(shù)量為每孔2×105個。實驗分為對照組和損傷組。對照組細(xì)胞直接培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實驗；損傷組細(xì)胞接種于24孔板預(yù)培養(yǎng)4 h后加入20 μmol/L順鉑處理20 h。在提取RNA時，將兩組細(xì)胞接種于層黏蛋白和多聚鳥氨酸預(yù)處理的6孔板中，細(xì)胞數(shù)量為2×106個。

1.2.2 免疫熒光染色檢測NF-200表達(dá)情況：為了評估順鉑暴露對DRG神經(jīng)元突起及生長錐形態(tài)的影響，通過免疫熒光染色檢測神經(jīng)元特異性骨架蛋白NF-200表達(dá)情況。取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛固定10 min，0.01%的triton X-100通透10 min，3%的山羊血清封閉30 min，NF-200一抗(稀釋比例為1∶2 000)室溫孵育3 h，PBST洗3次，二抗暗室孵育1 h，PBST洗3次，ddH2O洗1次，加入含DAPI的封片劑暗室放置30 min后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析基因表達(dá)差異：使用 RNeasy Plus Micro Kit 試劑盒進(jìn)行RNA 提取，將兩組RNA樣本送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司采用BGISEQ-500平臺進(jìn)行測序分析，每組2個重復(fù)。使用PossionDis方法進(jìn)行差異檢測，以log2(fold change)≥1或≤-1和FDR<0.001的基因默認(rèn)為差異表達(dá)基因(differential expression genes,DEGs)，并進(jìn)行KEGG生物通路富集分析。

1.2.4 qPCR檢測軸突導(dǎo)向相關(guān)基因mRNA表達(dá):使用1.2.3中試劑盒進(jìn)行RNA 提取，操作過程按照說明書要求進(jìn)行。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過TB GrenTMPremix Ex TaqTMⅡ 進(jìn)行qPCR擴增，反應(yīng)體系為10 μL。以B2M為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計算基因相對表達(dá)量(表1)。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequence of qPCR primers

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 順鉑對神經(jīng)元突起及生長錐的影響

NF-200免疫熒光結(jié)果顯示，對照組中DRG神經(jīng)元突起密集，而損傷組神經(jīng)元突起稀少(圖1A)；對照組生長錐生長狀態(tài)良好，而損傷組生長錐結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯坍塌并形成倒鉤狀回縮(圖1B)。

Neurite outgrowth from DRG soma was measured by immunofluorescence of NF-200(red);A.compared with control group,the injury group had fewer neurites,and the expression of NF-200 was lower at the end of the neurites (yellow,arrows),scale bar=20 μm;B.the growth cones in control group were well extended,while the microtubule skeleton structure of the growth cones were significantly changed and obvious barbed retract in injury group (yellow,arrows),scale bar=10 μm圖1 NF-200免疫熒光染色結(jié)果Fig 1 Results of NF-200 immunofluorescence staining

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及pathway功能分析

各樣品平均產(chǎn)出21.79 M數(shù)據(jù)，樣品比對基因組的平均比對率為 94.79%，比對基因集的平均比對率為90.52%，表明樣品之間數(shù)據(jù)具有可比性，數(shù)據(jù)可用性好。與對照組相比，損傷組上調(diào)383個、下調(diào)1 101個基因(圖2A)。KEGG生物通路富集分析顯示，DEGs顯著富集到20條通路(圖2B)，其中包括軸突導(dǎo)向通路。軸突導(dǎo)向通路參與神經(jīng)軸突及生長錐的發(fā)育，該通路基因表達(dá)改變影響神經(jīng)回路的形成。

A.the Volcano-plot of the DEGs,compared with control group,383 genes are up-regulated (red)and 1 101 genes were down-regulated (green)in the injury group;B.KEGG biopathway enrichment analysis showed the differentially expressed genes (DEGs)were significantly enriched in axon guidance pathways

2.3 兩組軸突導(dǎo)向相關(guān)基因差異分析

對231個軸突導(dǎo)向相關(guān)基因繪制熱圖和火山圖(圖3)。結(jié)果顯示組內(nèi)基因表達(dá)具有相似性，組間具有明顯差異(圖3A)；與對照組相比，損傷組中多數(shù)軸突導(dǎo)向相關(guān)基因呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)(圖3B)。以Log2(Fold change)≥1或≤-1和FDR≤0.001代表基因表達(dá)變化量差異，損傷組上調(diào)2個基因，下調(diào)49個基因。

A.clustering heat map analysis of 231 axon guidance related genes in two groups;B.Volcano-plot of the differentially expressed axon guidance genes;compared with control group,2 genes were up-regulated (red)and 49 genes were down-regulated (green)in the injury group

2.4 DEGs編碼蛋白質(zhì)互作關(guān)系分析

蛋白質(zhì)之間通常通過相互作用結(jié)合成復(fù)合物之后行使相應(yīng)的功能。根據(jù)STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫，對51個軸突導(dǎo)向相關(guān)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析(protein protein interaction network，PPI)，去除無互作關(guān)系的基因。大多數(shù)DEGs的蛋白質(zhì)具有直接相互作用，蛋白質(zhì)相互作用主要集中在Ntn1、Nrp1、Nrp2、Sema6a、plxna2、plxna4、Slit2、Robo1等基因之間。其中，與各蛋白質(zhì)聯(lián)系最密切的為Ntn1、Nrp1、Nrp2、plxna4等(圖4)。

Proteins interacted with each other to perform important physiological functions.Line thickness indicated the strength of data support,the thick line represented the stronger interaction圖4 DEGs的蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Protein interaction diagram of DEGs

2.5 軸突導(dǎo)向相關(guān)基因差異表達(dá)分析

根據(jù)各個樣品基因表達(dá)水平，F(xiàn)PKM ≤ 1為極低表達(dá)水平的基因，F(xiàn)PKM范圍在1～10為低表達(dá)水平的基因，F(xiàn)PKM≥10為中高表達(dá)水平的基因。中高表達(dá)量的基因?qū)τ诩?xì)胞生物學(xué)功能更加重要，選擇對照組FPKM≥10，Log2(Fold change)≥1或≤-1和FDR≤0.001的基因共有15個，順鉑處理后均呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)(表2)。

表2 15個DEGs基本信息Table 2 Information of the 15 DEGs

2.6 qPCR驗證部分軸突導(dǎo)向相關(guān)基因mRNA表達(dá)

選擇差異倍數(shù)較大且在蛋白互作中與其他蛋白聯(lián)系較為密切的DEGs進(jìn)行qPCR驗證。差異基因的mRNA相對表達(dá)量變化趨勢與RNA-seq檢測結(jié)果趨勢一致，表明順鉑暴露后這些基因的表達(dá)下調(diào)(圖5)。

3 討論

順鉑是常用的化療藥物，它的神經(jīng)毒性和相關(guān)的外周神經(jīng)病變阻礙其在癌治療中的積極作用，而目前關(guān)于順鉑神經(jīng)毒性研究并不十分清楚，深入探討其毒性機制有助于減輕順鉑副作用并促進(jìn)癌治療效果。

DRG神經(jīng)元是高度極化的細(xì)胞，是感覺神經(jīng)傳遞樞紐，其軸突生長及生長錐正確導(dǎo)向并形成突觸連接才能發(fā)揮正常的生理功能。研究表明，軸突導(dǎo)向相關(guān)基因表達(dá)參與軸突生長及神經(jīng)回路的形成[6]。本研究結(jié)果中，順鉑導(dǎo)致軸突數(shù)量減少、長度縮短及生長錐結(jié)構(gòu)坍塌與回縮，且隨著順鉑濃度增加軸突損傷越明顯(結(jié)果未展示)，表明順鉑能夠抑制軸突生長及生長錐延伸并呈現(xiàn)劑量依賴性，這可能與順鉑改變軸突導(dǎo)向基因的表達(dá)有關(guān)。軸突導(dǎo)向基因表達(dá)產(chǎn)物多為軸突導(dǎo)向信號分子或者特異性受體，參與軸突生長發(fā)育調(diào)節(jié)。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子(Ntn-1)通過與受體的特異性結(jié)合，誘導(dǎo)軸突的靶向生長、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞遷移和存活、同時可抑制神經(jīng)元凋亡[7]。神經(jīng)纖毛蛋白-1(Nrp1)是單次跨膜受體，與Sema3a結(jié)合介導(dǎo)神經(jīng)元軸突生長、導(dǎo)向及遷移[8-9]。信號素分子(semaphorinsa，semas)是廣泛存在的導(dǎo)向分子蛋白質(zhì)超家族，調(diào)節(jié)軸突引導(dǎo)和細(xì)胞遷移過程，如Sema6A[10]、Sema7A[11]。神經(jīng)叢蛋白(plexins)是信號素家族受體，信號素分子通過神經(jīng)叢蛋白參與軸突導(dǎo)向、神經(jīng)元遷移等生理過程[12]。Slit家族參與神經(jīng)軸突生長及神經(jīng)細(xì)胞遷移的導(dǎo)向作用，Slit與受體Robo結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[13]。軸突引導(dǎo)信號分子與受體相互作用，調(diào)控軸突生長及生長錐的導(dǎo)向功能。如NELL2-Robo3復(fù)合物參與軸突的排斥[14]；Sema3a-Nrp1/Plxna4信號通路促進(jìn)皮層神經(jīng)元基底樹突分枝，但也排斥軸突[15]；Ntn1與Dcc結(jié)合引導(dǎo)軸突生長和細(xì)胞定向遷移[16]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示順鉑導(dǎo)致眾多軸突導(dǎo)向基因表達(dá)下調(diào)，且大多數(shù)DEGs的蛋白質(zhì)直接具有相互作用，表明順鉑下調(diào)軸突導(dǎo)向相關(guān)基因表達(dá)可能抑制神經(jīng)元軸突發(fā)育。

*P<0.05 compared with control group圖5 qPCR檢測各基因mRNA相對表達(dá)量Fig 5 Relative mRNA expression levels by n=3)

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析順鉑暴露對軸突導(dǎo)向基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明順鉑導(dǎo)致軸突導(dǎo)向相關(guān)基因表達(dá)下降可能是順鉑神經(jīng)軸突毒性的重要原因，但順鉑下調(diào)這些基因的具體機制還有待探索。本研究結(jié)果對于進(jìn)一步認(rèn)識順鉑毒性機制并為如何改善順鉑導(dǎo)致的神經(jīng)損傷副作用提供新的研究思路。