分子伴侶Rer1參與人胚胎腎上皮細胞系HEK293T中hERG鉀通道蛋白轉運

陳邦盛，余小玲，毛飛燕，廉姜芳，俞徐云*

(1.寧波市鄞州第二醫院 急救醫學中心，浙江 寧波 315192；2.中國科學院大學寧波華美醫院(寧波市第二醫院)普外科，浙江 寧波 315010；3.寧波市醫療中心李惠利醫院興寧院區 心血管內科，浙江 寧波 315040)

遺傳性長QT綜合征(hereditary long QT syndrome，hLQTS)是一組編碼心肌復極化離子通道HERG(human ether-à-go-go related gene,hERG)基因突變而導致的一種遺傳性離子通道病，臨床上以QT間期延長、尖端扭轉型室速、暈厥甚至猝死為主要表現[1-2]。研究表明，hLQTS的發病機制是由于內質網質量控制系統使錯誤折疊的hERG變異體滯留在內質網致細胞膜成熟hERG鉀通道蛋白減少[3]。在多肽鏈折疊轉運過程中，分子伴侶常識別并結合于折疊中間產物的疏水端，防止多肽鏈異常聚集，直至其折疊成為正確或相對正確結構才與之分離[4]，目前對于分子伴侶輔助新生蛋白折疊轉運的研究多集中在內質網區域，近期研究表明，內質網后質量控制系統在相關的構象疾病中發揮重要作用[5]，但對疾病的潛在影響尚不清楚，Rer1是位于內質網高爾基中間體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)的分子伴侶[6]，其在蛋白質轉運過程中發揮一定作用，但對hERG鉀通道的轉運機制仍不明確。本研究利用免疫熒光、免疫印跡及膜片鉗等方法，探究Rer1在hERG鉀通道蛋白轉運過程中的作用，從而為hLQTS發病機制的研究提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎上皮細胞系(HEK293T)和質粒pcDNA3-hERG、pcDNA3-hERG-A561V(寧波市醫療中心李惠利醫院中心實驗室)；DMEM培養基(Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；Rer1(山羊來源)一抗(Novusbio公司)；HERG(兔來源)一抗(Alomone公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；Baf A1(Abcam公司)；siRNA-Rer1質粒(上海吉凱基因公司合成)；質粒中提試劑盒(Omega公司)。

1.2 方法

1.2.1 質粒的制備及細胞的培養：擴增并提取質粒，測DNA濃度和純度。復蘇HEK293T細胞后，按比例接種于60 mm的培養皿中，加入高糖DMEM 4 mL，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育。

1.2.2 細胞模型的分組構建及處理：將HEK293T細胞按2×105個/mL的濃度接種在有蓋玻片的60 mm培養皿中，待匯合至90%左右，分別轉染pcDNA3-WT-HERG、pcDNA3-A561V-HERG、pcDNA3-WT/A56lV-HERG各2.5 μg構建野生、突變及混合轉染細胞模型。

1.2.3 Western blot檢測各組hERG及Rer1蛋白的表達：培養各組細胞48 h后提取蛋白并BCA法測濃度，配制12% SDS-PAGE分離膠，電泳1.5 h后轉膜，隨后用5%的脫脂奶粉封閉1 h并用TBST洗4次，分別加一抗(HERG 1∶400；Rer1 1∶200)后4 ℃冰箱過夜。次日吸出一抗，TBST清洗后加用二抗(tubulin 1∶1 000)孵育1 h后進行曝光，實驗數據采用image J軟件定量分析。

1.2.4 免疫熒光檢測各組hERG蛋白的表達：采用4%的多聚甲醛固定細胞，PBS浸洗后用0.5% Triton X-100室溫通透20 min，再次浸洗后滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min，棄封閉液，培養皿中滴加足量的一抗HERG(1∶25)，4 ℃孵育過夜；次日吸干液體后滴加熒光二抗Cy3(1∶200)，37 ℃孵育30 min后滴加DAPI避光孵育5 min，用20%甘油封閉培養皿，熒光顯微鏡觀察采集圖像。

1.2.5 Western blot檢測Rer1敲低后hERG蛋白的表達：在構建的各組細胞中分別加入siRNA-Rer1及scramble質粒共9組，繼續培養各組細胞48 h后提取蛋白并采用Western blot檢測蛋白質表達水平(步驟同1.2.3)。

1.2.6 Western blot檢測Baf A1孵育后hERG蛋白的表達：培養細胞構建各細胞模型，采用Baf A1以1 mmol/L的濃度進行孵育6 h，Western blot檢測hERG的表達(步驟同1.2.3)。

1.2.7 膜片鉗技術記錄Baf A1孵育前后混轉細胞的電流：消化各組細胞并待細胞貼壁穩定后選取熒光度強、細胞表面光滑、狀態佳的細胞，通過顯微操縱儀使電極尖端與細胞膜形成巨阻抗封接，待阻抗達1 GΩ以上，撤除負壓后給予破膜，并使破膜后電阻亦維持在1 GΩ以上，記錄各細胞電容。維持鉗制電壓-80 mV，測試電壓從-60 mV開始，以10 mV為階躍，刺激至+60 mV，然后復極化到-40 mV，持續4 s,繼之回到-80 mV，尾電流在-40 mV期間獲得。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 hERG及Rer1在細胞內的表達

野生組hERG蛋白表達未成熟的135 ku及成熟的155 ku蛋白，A561V突變組表達135 ku蛋白及極少量155 ku蛋白，混轉組則以表達未成熟的135 ku蛋白為主，并部分表達155 ku蛋白。與野生組相比，混轉組未成熟hERG蛋白明顯升高(P<0.01)，突變組則明顯減低(P<0.05)；而成熟hERG蛋白在突變組顯著下調(P<0.01)(圖1A，B)。此外，Rer1是一種分子質量為23 ku高爾基體側的分類受體，相對于野生組，Rer1的表達量在突變組及混轉組中明顯降低(P<0.01)(圖1C，D)。

A.hERG expression detected by Western blot；B.relative expression of hERG；*P<0.05，**P<0.01 compared with WT group in 135 ku group；#P<0.01 compared with WT group in 155 ku group；C.Rer1 expression detected by Western blot；D.relative expression of Rer1，**P<0.01 compared with WT group

2.2 免疫熒光染色檢測細胞內hERG的表達

A561V突變組與對照組及野生組相比細胞分布明顯減少、細胞聚集成團，且突變組hERG蛋白在細胞質中明顯聚集，而其余幾組均有細胞膜及細胞質的定位，在融合圖像中，混轉組與野生組相比，hERG蛋白的膜表達有所減少(綠色熒光代表hERG，藍色熒光代表核染色)(圖2)。

圖2 免疫熒光染色分析各組hERG蛋白的表達Fig 2 Analysis of hERG expression by immunofluorescence staining in each (×200，scale bar=100 μm)

2.3 Rer1參與hERG蛋白的細胞內轉運并抑制其順向轉運

與空白對照組相比，采用小干擾RNA技術成功敲低Rer1表達水平后(圖3A)，各組細胞中未成熟hERG蛋白對于Rer1的下調并不十分敏感，此外，與scramble對照組相比，僅混轉組出現未成熟hERG蛋白的減低，但無顯著性差異(圖3B)；而相對于空白組，各組細胞中成熟hERG蛋白的表達均有一定水平的增加，在野生組中成熟hERG蛋白明顯增加(P<0.05)，同時，與scramble對照組相比，野生組成熟hERG蛋白表達亦明顯增加(P<0.05)(圖3C)。

2.4 Baf A1孵育促進hERG蛋白細胞內轉運

與對照組相比，在采用Baf A1孵育后混轉組未成熟hERG蛋白的表達水平明顯上調(P<0.05)(圖4A,B)；此外，野生及突變組成熟hERG蛋白的表達在Baf A1孵育后顯著高于對照組(P<0.05)，而混轉組成熟hERG蛋白并無顯著差異(圖4A,C)。

2.5 Baf A1孵育混轉細胞后增強hERG尾電流

混轉組細胞未進行Baf A1孵育時，尾電流較小，而采用Baf A1進行孵育后，電流密度得到明顯增強，并且激活電壓從-20 mV到60 mV，混轉細胞中Baf A1孵育組細胞株尾電流相對電流密度明顯高于混轉對照組(P<0.05)(圖5)。

scr-siRNA.scramble-siRNA；A.knockdown of Rer1 on expression of hERG was detected by Western blot；B.relative expression of 135 ku hERG；C.relative expression of 155 ku hERG；*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with scramble control group

A.expression of hERG was detected by Western blot under treated with or without Baf A1；B.relative expression of 135 ku hERG；C.relative expression of 155 ku hERG；*P<0.05 compared with control

3 討論

蛋白質轉運異常致未成熟hERG蛋白滯留內質網是hLQTS的主要致病機制，異常蛋白的滯留引發內質網應激并觸發未折疊蛋白形成[7-8],有研究表明內質網后區室的分子伴侶是蛋白質早期分泌途徑的重要質量控制因子[9]，因此，深入探討內質網后區室分子伴侶與hLQTS的內在機制，對于hLQTS發病機制的研究具有重要意義。

Rer1是一個典型的內質網后區室分子伴侶，已證實Rer1參與γ-分泌酶的細胞內轉運，下調Rer1可以削弱Notch信號并導致小鼠大腦皮層發育受損[10]。此外，Fet3p、Secl2p、Mns1p和Sec71p等多種蛋白也可在Rer1p的作用下被逆轉運回內質網[11]。但是，Rer1在蛋白轉運異常致hLQTS的研究尚無相關報道。本研究采用HEK293T細胞構建野生、突變、混轉細胞模型，發現A561V突變可致hERG蛋白轉運異常并使Rer1表達明顯減低，而小干擾 RNA(siRNA)敲低Rer1表達可促進部分相對成熟hERG蛋白的順向轉運，表明Rer1參與了hERG通道蛋白的細胞內轉運而且對于異常蛋白可能起較強的識別及逆轉運作用，從而保證了分泌蛋白的正確構象。

A,B.representative IhERG recordings respectively under Baf A1 treated and untreated conditions;C.mean normalized tail current data for each expression conditionare plotted following each command pulse

研究證實混轉型通道蛋白并非功能完全喪失，錯誤折疊但部分功能蛋白的過早降解是導致LQTS和囊性纖維化等構象病的致病機制[5]，若能正常轉運至細胞膜仍能發揮一定的代償功能[12]。既往研究表明，高濃度的Baf A1可以抑制蛋白從高爾基體向內質網的逆向轉運[13]，這與敲低Rer1表達有類似作用。在本研究中，采用Baf A1孵育可使野生及突變組成熟hERG蛋白明顯增加，而混轉組則僅僅表現為未成熟hERG蛋白顯著上調，為此，進一步通過膜片鉗對有潛在功能的混轉細胞檢測膜電流，發現Baf A1孵育后尾電流密度明顯強于對照組，這表明Baf A1雖然不能使混轉組成熟hERG蛋白的表達增加，但仍可增強混轉組細胞膜上的尾電流，出現這種結果的可能原因是Baf A1抑制了核內體的內吞從而導致混轉組未成熟hERG蛋白的顯著增加，但Baf A1同時也增強了混轉組hERG鉀離子通道蛋白的質膜循環從而導致膜電流增加。

綜上所述，分子伴侶Rer1主要通過介導蛋白的逆向轉運參與hERG鉀通道蛋白轉運，而敲低Rer1可以促進蛋白的順向轉運。此外，對于有潛在功能的混轉型細胞Baf A1可以恢復hERG鉀通道的膜電流，這也為hLQTS發病機制的研究提供了一種新的思路。