甲基紫顯色法研究幾種常見中藥成分的抗氧化自由基活性及其機理*

郭新穎，顧 俊，陳 峰，戴志英，楊梅桂

（南通市疾病預(yù)防控制中心 理化科，江蘇 南通226007）

羥自由基（hydroxyl free radical，·OH）是機體中活性氧的一種，它不僅是維持正常生命過程的必需物質(zhì)，還是殺死紅細(xì)胞、降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物的元兇[1-3]。作為生物體的破壞者，在體內(nèi)自由基失衡的非正常的生理水平上，·OH通過攻擊生物大分子導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，從而引起人類的各種疾病[4-6]。因此，為清除體內(nèi)多余自由基，國內(nèi)外已將具有抗氧化成分的天然與合成類抗氧化劑的研究開發(fā)作為主要方向，尤其是對中藥進(jìn)行了大量研究[7-10]。本文從中藥提取物的的清除·OH的能力作為其主要抗氧化指標(biāo)，以甲基紫（methyl violet，MV）作為顯色劑，結(jié)合分光光度法的試驗方法進(jìn)行了中藥清除·OH作用的初步研究，對可能產(chǎn)生的反應(yīng)機理進(jìn)行了分析探討，以期對中藥進(jìn)行體外抗氧化活性相關(guān)研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

UNICO7200型分光光度計（上海分析儀器廠）；FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；CS501超級恒溫槽（重慶實驗設(shè)備廠）；PHS-3CpH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；量筒、稱量紙、玻璃攪拌棒、藥品勺、試劑瓶若干。

1.2 材料與試劑

甲基紫（5.15×10-5mol·L-1），F(xiàn)eSO4（1.5×10-4mol·L-1），H2O2（0.3%），Na2HPO4,檸檬酸，H3PO4，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中藥為市售。

Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制9.35mL 0.2mol·L-1Na2HPO4和10.65mL 0.1mol·L-1檸檬酸混合，HCl精確調(diào)至pH值為4.5。

1.3 試驗原理

Fenton試劑反應(yīng)是目前已知的產(chǎn)生·OH的經(jīng)典方法，·OH是在整個反應(yīng)中起主要氧化作用的物質(zhì)，它與有機染料如染色劑、顯色劑、熒光劑、抗氧化劑等反應(yīng)的主要途徑是奪取氫原子、發(fā)生電子轉(zhuǎn)移以及產(chǎn)生加成反應(yīng)的過程。目前，公認(rèn)的鐵基Fenton體系的反應(yīng)方程式可簡便表述為：

從以上反應(yīng)簡式看出，反應(yīng)式中的整條反應(yīng)鏈實際上是在Fe2+的催化作用下將H2O2全部消耗生成H2O和O2的凈反應(yīng)，中間產(chǎn)物·OH可引發(fā)鏈反應(yīng)產(chǎn)生更多自由基來消耗目標(biāo)物。本試驗是以甲基紫MV作為有機化合物，在酸性條件下顯色，反應(yīng)體系中·OH憑借極高的電負(fù)性（Ep=2.80V）有選擇性地進(jìn)攻甲基紫的高電子云密度點如-C=C-基團(tuán)，同時發(fā)生親電加成反應(yīng)，以甲基紫褪色作為反應(yīng)終點[11]。

1.4 計算公式

·OH清除率實驗是體外抗氧化活性試驗的一種常用的評價檢測方法，主要是利用顯色劑在含有·OH的反應(yīng)體系中會降低體系的吸光度，而吸光強度的降低程度又與·OH有著比較明顯的量效關(guān)系，因而可以根據(jù)這個原理間接地測定·OH的產(chǎn)生量，從而較為準(zhǔn)確地評價某一物質(zhì)的體外抗氧化活性[12]。

反應(yīng)體系清除率CR%的計算公式為：

其中，加入抗氧化劑的反應(yīng)體系吸光度值記作AS，未加入抗氧化劑的反應(yīng)體系吸光度值記作A，空白參比吸光度值記作A0，·OH反應(yīng)前后溶液的吸光度變化差值記作ΔA。計算結(jié)果用百分制（%）表示。

1.5 樣品處理

中藥經(jīng)清洗晾干后用粉碎機粉碎。準(zhǔn)確稱取粉末5.0g，用50mL蒸餾水水浴加熱60min，過濾離心后得到中藥水提物，試驗時取處理后的上清液1mL待測。

1.6 樣品測定

試驗測定參照劉立明[13]的方法。在2支10mL比色管中按先后順序依次加入1.0mL 5.15×10-5mol·L-1MV溶液和1.0mL Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH值為4.5），一支作為試劑空白參比，另一支繼續(xù)加入1.0mL 1.5×10-4mol·L-1FeSO4溶液和1.0mL 0.3%的H2O2溶液作為反應(yīng)體系。兩體系溶液均定容至10.0mL，室溫放置5min后，在分光光度計上以582nm吸收波長配1cm比色皿測定各體系吸光度變化值ΔA并計算清除率CR%。

2 結(jié)果與討論

2.1 體系吸收光譜

在pH值為4.5的弱酸性介質(zhì)中，分別測定MV和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收曲線，得到的兩種溶液吸收光譜圖。試驗發(fā)現(xiàn)，單一MV溶液和MV-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系溶液的最大吸收波長均在582nm附近且吸光度值不變，被氧化的MV-Fe2+-H2O2反應(yīng)體系溶液吸光度明顯降低，但是最大吸收波長并沒有變化，因此，本試驗確定兩體系溶液的測定波長為582nm。

2.2 試驗影響因素分析

2.2.1 顯色劑用量的影響 由于顯色劑MV的濃度大小對反應(yīng)現(xiàn)象的觀察與檢測有較大影響，故有必要對MV的用量進(jìn)行考察。本試驗選擇濃度為5.15×10-5mol·L-1的MV溶液，考察了MV溶液體積分別為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個不同體積用量對體系吸光度的影響。結(jié)果見圖1。

圖1 顯色劑用量的影響Fig.1 Effect of different volume and dosage of chromogenic reagent

由圖1可見，ΔA值隨MV用量的逐漸增大而增加；當(dāng)用量達(dá)1.0mL時ΔA值最大，故本試驗選用MV溶液1.0mL。

2.2.2 酸度的影響 分別配制pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0共7個pH值的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進(jìn)行試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of pH

由圖2可知，在弱酸條件下有利于Fenton反應(yīng)中·OH的生成，故本試驗選用pH值為4.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，按試驗方法分別測定空白體系與反應(yīng)體系的吸光度差值ΔA。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，ΔA值隨酸度用量增加而增大；當(dāng)用量為1.0mL時，ΔA值趨于最大，綜合考慮將本試驗緩沖溶液的用量定為1.0mL。

2.2.3 Fe2+用量的影響FeSO4作為反應(yīng)體系的反應(yīng)物濃度，F(xiàn)e2+的濃度會對·OH的產(chǎn)生量產(chǎn)生影響，本試驗選用1.5×10-4mol·L-1的FeSO4溶液，按實驗方法對Fe2+體積分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個不同用量對體系吸光度的影響進(jìn)行分析。結(jié)果見圖3。

圖3 Fe2+用量的影響Fig.3 Effect of different volume of Fe2+

由圖3可知，隨著FeSO4用量的增加，ΔA呈現(xiàn)增大的趨勢；當(dāng)用量達(dá)到1.0mL時ΔA趨于穩(wěn)定。故本試驗FeSO4溶液的用量為1.0mL。

2.2.4 H2O2用量的影響 ·OH的產(chǎn)量和反應(yīng)程度也受反應(yīng)物H2O2濃度的影響。分別加入體積為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL共7個不同用量的0.3% H2O2溶液，考察吸光度變化值ΔA。結(jié)果見圖4。

圖4 H2O2用量的影響Fig.4 Effect of different volume of H2O2

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，ΔA隨著H2O2用量的增加而增大；當(dāng)用量超過1.0mL時，ΔA吸光度值變化不大，故本實驗選用H2O2溶液1.0mL。2.2.5反應(yīng)時間的影響 試驗考察了反應(yīng)時間分別為1、2、4、6、8和10min共6個時間點對體系的吸光度變化值ΔA影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0~5min內(nèi)，吸光度隨時間的增大而增大，5min后ΔA值基本無變化。故本試驗測定時間選為5min。

2.3 中藥提取物的抗氧化活性

本試驗以抗·OH清除能力作為評價中藥體外抗氧化活性的性能指標(biāo)，對當(dāng)歸、山楂、葛根、菊花和枸杞等5種中藥水提取物的抗·OH清除能力（以清除率計）進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

表1 5種中藥提取物對·OH的體外清除作用（n=6）Tab.1 Scavenging effects of extracts in 5 TCMs（n=6）

由表1可見，5種中藥水提物都有一定程度的抗·OH清除能力，但清除能力大小有較大差別，5種中藥·OH清除能力及清除率數(shù)值從大到小依次為：當(dāng)歸45.28%，山楂42.17%，葛根38.58%，菊花33.41%，枸杞12.94%。5種中藥·OH清除能力的不同反映了其各自抗氧化能力的大小，這表明5種中藥水提物存在不同組分的抗氧化活性物質(zhì)，也間接證明了這5種中藥抗氧化能力的大小或可與各物質(zhì)所含有的不同抗氧化成分有關(guān)。

2.4 中藥抗氧化的機理

探討近年來所有生化研究中的芬頓（Fenton）反應(yīng)型中，已知的幾種中藥主要抗氧化成分最受關(guān)注的是黃酮類化合物，因其結(jié)構(gòu)式中含有若干個苯環(huán)三碳鏈（C6-C3-C6）骨架和酚羥基（直接與芳香烴相連的羥基，R-OH），且目前已知的多數(shù)中藥提取物中均可分離出具有較強的清除自由基能力的黃酮類物質(zhì)[14]。鑒于此，本試驗所選取的5種中藥均具有抗氧化成分黃酮類，認(rèn)為這幾種中藥中的黃酮類化合物可以通過直接與芳香烴相連的羥基（酚羥基，R-OH）與·OH反應(yīng)生成穩(wěn)定化合物中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑或與鐵基金屬離子絡(luò)合降低催化反應(yīng)速率，通過以上作用機制來清除體系·OH。也有研究指出，中藥的加入之所以能夠防止機體過氧化，是因為中藥成分中的黃酮類化合物以氫鍵形式發(fā)生反應(yīng)[15]，通過阻止體系的不飽和鍵與·OH上的不成對電子接觸或反應(yīng)，以此降低過氧化程度，使中藥的抗氧化能力得到有效保護(hù)。同時，本文以甲基紫-芬頓體系（MVFenton）作為體外模擬試驗體系中，發(fā)揮主要催化作用的是Fe2+，·OH處于激發(fā)態(tài)且?guī)в幸粋€不成對電子，F(xiàn)e2+的加入會將·OH催化分解為H2O2，從而抑制·OH的過氧化作用。以上反應(yīng)機理與本文對中藥的抗氧化機理的研究相一致。

3 結(jié)語

本文通過選擇MV作為試驗顯色體系，以中藥的抗·OH清除率作為評價中藥的抗氧化活性指標(biāo)，對5種中藥水提物進(jìn)行體外抗氧化活性的比較分析，對中藥在體外的抗氧化性能的反應(yīng)機制及其機理研究進(jìn)行了初步探索。以上試驗結(jié)論可以為在體內(nèi)的中藥作為抗氧化劑抗氧化作用和生理功效的關(guān)系研究提供相關(guān)理論參考。總之，中藥作為天然藥物的來源，因其毒副作用小、安全性高，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于中藥成分的復(fù)雜性，抗氧化機理研究等尚處于初步探索階段，針對中藥抗氧化成分分析及其作用機制尚有待于更加深入的試驗研究。