石榴皮中黃酮類物質的提取及抗氧化研究*

張麗君，李 敏，王 靜，魯強國，馬潘潘

（西安文理學院 化學工程學院，陜西 西安710065）

石榴素以色澤艷麗，果大皮薄，汁多味甜，核軟鮮美，籽肥渣少，品質優良等特點而著稱。石榴皮、花、葉、根部都可入藥,它性味甘、酸、溫、澀而無毒，并含有多種生物堿、鞣質等。現代藥理研究也表明，石榴皮中含有多種生理活性物質，具有抗癌、鎮痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、提高免疫能力等藥用保健功能,還有降壓、降血脂、增加冠脈流量、強心、抗心律不齊等藥理作用[1]。石榴皮主要成分有鞣質酸類化合物、沒食子酸類化合物、黃酮類化合物、有機酸類化合物、生物堿類化合物。石榴皮中含量較高的黃酮類化合物，能夠降低不同類型自由基的活性，具有一定的藥用價值。作為天然抗氧化劑可以從天然食材中提取得到，相比合成抗氧化劑具有其他生物學功能，日益被國內外關注[2]。

江飛鳳[3]等以柚子皮為原料，采用超聲-微波協同提取技術提取柚子皮多糖，優化最佳提取工藝，對其進行脫色、脫蛋白處理，對其單糖組成、結構和抗氧化活性進行分析。本文采取乙醇浸提法、纖維素酶輔助法、超聲波法及微波法從石榴皮中提取黃酮。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定石榴皮提取液中黃酮類物質的含量,并進行體外抗氧化研究，研究對種自由基的清除作用，為石榴作為天然抗氧化劑和功能性食品的開發利用提供理論基礎和實驗依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

石榴皮（西安老百姓大藥房）；蘆丁（AR國藥集團化學試劑有限公司）；NaNO2（AR西安化學試劑廠）；Al（NO3）3（AR西安富力化學廠）；NaOH（AR西安化學試劑廠）；VC（AR天津市天力化學試劑有限公司）；無水乙醇（AR天津市天力化學試劑有限公司）；FeSO4·7H2O（AR汕頭市西隴化工廠有限公司）；水楊酸（AR天津市天力化學試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（AR阿拉丁）；鄰苯三酚（AR天津市科密歐化學試劑有限公司）；DPPH試劑（AR阿拉丁）。

FW80型微型高速萬能粉碎機（鄭州科豐儀器設備有限公司）；722N型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；YP202N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；SB-5200DT型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LWMC-205型微波反應器（南京陵江科技開發有限公司）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 黃酮類化合物的提取

1.2.1.1 樣品與處理 稱取石榴皮200g，在烘箱中60℃烘干24h，取出后用粉碎機粉碎備用。

1.2.1.2 各種提取方法的最佳工藝條件（見表1）

表1 各提取方法的最佳工藝條件Tab.1 Optimum conditions for each extraction method

1.2.1.3 乙醇索氏提取 稱取3g石榴皮樣品，裝入濾紙桶中，量取60mL 65%的乙醇，倒入250mL的圓底燒瓶，安裝好索氏提取器，開始反應，虹吸5次左右，離心后得到石榴皮提取液，最后用65%乙醇定容到100mL容量瓶中。

1.2.1.4 纖維素酶輔助法 稱取3g石榴皮樣品裝入100mL燒杯中，加入30mL蒸餾水和7.5mg纖維素酶，調節pH值為6~7，在45℃水浴中酶解30min，倒入250mL圓底燒瓶中，加入30mL 95%乙醇，保持溫度90℃，回流1.5h，離心后得到石榴皮提取液，最后用95%乙醇定容到100mL容量瓶中[4]。

1.2.1.5 超聲波法 稱取3g石榴皮樣品裝入250mL燒杯中，加入60mL 60%乙醇，在50℃條件下超聲25min，離心，取上清液，合并濾液，用60%乙醇定容到100mL容量瓶中[5]。

1.2.1.6 微波法 稱取3g石榴皮樣品裝入250mL燒杯中，加入75mL 70%乙醇，在功率為600W條件下微波3次,每次2min，離心，取上清液，合并濾液，用70%乙醇定容到100mL容量瓶中[6,7]。

1.2.2 石榴皮中黃酮類物質的含量測定

本實驗利用NaNO2-Al（NO3）3比色法，即在中性或弱堿性及NaNO2存在下，黃酮與鋁鹽生成螯合物，加入NaOH顯紅橙色。準確稱取蘆丁標準品10.00mg于小燒杯中，用30%乙醇溶解，定容于50mL的容量瓶，搖勻。得到濃度為0.2mg·mL-1的蘆丁標準溶液。準確吸取標準液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于25mL容量瓶中，編號為1~6。加入5%的NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，搖勻。以試劑空白為參比，15min后于490~530nm內掃描，確定最大吸收波長。在最大吸收波長處，測定不同濃度蘆丁標準品的吸光度，得到吸光度A與蘆丁含量C（mg·mL-1）之間的回歸方程。

將4種方法提取所得的4組粗提液，分別吸取1.0mL于25mL的容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，搖勻，放置6min后加入4%的NaOH溶液4mL，再用30%乙醇定容，搖勻，以試劑空白為參比，15min后，在最大吸收波長處測定吸光度，代入回歸方程中即可求得石榴皮中黃酮類物質的含量（質量濃度），從而來計算石榴皮中黃酮類物質的提取率。石榴皮中黃酮類物質的提取率=[（提取液濃度×體積×稀釋倍數）/原料質量]×100%

1.2.3 抗氧化性實驗

1.2.3.1 清除DPPH·自由基能力的測定 準確稱取DPPH·0.0079g于小燒杯中，用無水乙醇溶解，定容于100mL的容量瓶，搖勻后得到濃度為0.2mmol·mL-1的DPPH·溶液。在25mL比色管中加入2mL 0.2mmol·mL-1DPPH·溶液再加入2mL無水乙醇，搖勻后溫室避光靜置30min，在517nm處測量吸光度，平行測定3次，取其平均值得到A0；同樣的方法，再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，測得Ai；最后在25mL比色管中加入2mL無水乙醇再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC和提取液+VC，測得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取物液的吸光度；Aj：不含DPPH·的吸光度。

1.2.3.2 清除·OH能力的測定 配制5份不同濃度的石榴皮提取液，取出2mL于試管中，依次加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，加入6mmol·L-1水楊酸2mL，搖勻，37℃反應30min，在510nm下測吸光度A0；同樣的方法，再加入5份不同濃度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，測得Ai；最后在25mL比色管中加入6mmol·L-1FeSO4溶液2mL，6mmol·L-1H2O22mL，5份不同濃度的石榴皮提取液、VC、提取液+VC，測得Aj。

式中A0：不含提取物液的吸光度；Ai：加入石榴皮提取液的吸光度；Aj：不含水楊酸的吸光度。

計算清除率=[（ΔA0-ΔA）/ΔA0]×100%

式中 ΔA0：鄰苯三酚自氧化速率；ΔA：加入石榴皮提取液后鄰苯三酚自氧化速率。

2 結果與討論

2.1 標準曲線繪制

按1.2.2的方法以試劑空白為參比，在510nm下測得不同濃度的蘆丁標準溶液的吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制的標準曲線，見圖1,得到線性回歸方程：Y=10.659X+0.0818，R2=0.999,有良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 4種方法提取石榴皮中黃酮類物質的提取率

圖2 為4種方法提取石榴皮中黃酮類物質的提取率。

圖2 4種方法提取石榴皮中黃酮類物質的提取率Fig.2 Extraction rate of pomegranate flavonoids by four methods

由圖2可知，在比較了4種不同方法提取石榴皮中黃酮類物質，4種方法提取物濃度分別為1.87，2.96，4.37，4.73mg·mL-1。結果表明，其提取率由高到低的順序為：微波法＞超聲波法＞酶輔助法＞乙醇提取法。

2.3 抗氧化性測定

2.3.1 石榴皮中黃酮類化合物對DPPH·的清除作用

由圖3可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除DPPH·自由基，相同濃度下，清除能力大小為：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取物＞VC。各溶液的清除能力都隨濃度的增大而增大，而且VC有協同作用。

圖3 石榴皮提取物對DPPH·的清除能力Fig.3 Clearing ability of pomegranate extract to the DPPH·

2.3.2 石榴皮中黃酮類化合物對·OH的清除作用

圖4 為石榴皮提取物對·OH的消除能力。

圖4 石榴皮提取物對·OH的清除能力Fig.4 Clearing ability of extract to the·OH

由圖4可知，石榴皮提取液、VC、提取液+VC清除·OH，在相同濃度下，清除能力大小為：石榴皮提取液+VC＞石榴皮提取液＞VC。各溶液的清除能力都隨濃度的增大而增大，而且VC有協同作用。

圖5 石榴皮提取物對·的清除能力Fig.5 Clearing ability of pomegranate extract to the·

3 結論

本實驗分別采用乙醇提取法、酶輔助法、超聲波法和微波法4種方法提取石榴皮中黃酮類物質，實驗數據表明，微波法提取效率最高，達4.73%，最佳提取條件為料液比1∶25（g∶mL），提取次數為3次，每次2min，提取功率600W，乙醇濃度70%；超聲法提取效率次之，達4.37%，最佳提取條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取時間25min，提取溫度50℃，乙醇濃度60%。

抗氧化劑在藥品、化妝品及保健品中具有廣闊的市場前景。近年來,在黃酮類化合物抗衰老作用的研究方面,許多科研工作者發現這類活性成分能夠延緩神經系統、免疫器官、生殖系統、肝臟和皮膚等組織的衰老[8]。期望為石榴皮作為天然抗氧化劑和功能性食品得到開發利用提供理論基礎和實驗依據。