超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉、雞蛋中9種獸藥殘留

李成 王錫蘭 姚東校 徐彬

(1海南省食品藥品檢驗所三亞分所海南三亞572000;2海南省食品檢驗檢測中心海南海口570301)

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考屬于氯霉素類藥物，是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用［1］，由于氯霉素對人體危害較大［2-3］，我國農業農村部第250號公告［4］已將氯霉素列在動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中。甲砜霉素和氟苯尼考在GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》［5］中也規定了最大殘留限量值。金剛烷胺和金剛乙胺同屬抗病毒類藥物，主要用于流感的預防和早期的治療，但是大量的殘留會對機體的神經系統造成較大的危害［6］，我國農業農村部已于2005年發布第560號公告禁止金剛烷胺和金剛乙胺獸用［7］。恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物具有廣譜高效、價格低廉等優點，被廣泛用于動物疾病治療、預防及促生長方面，但長期不規范使用會產生藥物殘留和細菌耐藥性問題［8］。農業農村部第2292號公告規定，在食品動物中停止使用培氟沙星和氧氟沙星，GB 31650—2019也對恩諾沙星在動物性食品中殘留限量進行了明確規定。雞蛋和雞肉作為動物源食品的重要組成部分，含有豐富的優質蛋白，深受大眾喜愛，雞肉和雞蛋食用安全的重要性不言而喻。但是目前國家標準和行業標準對動物源食品中獸藥殘留的檢測多適用于雞肉基質，而且同時檢測雞肉和雞蛋中氯霉素類、抗病毒類和喹諾酮類獸藥殘留的研究較少，因此建立一種快速、靈敏、準確的方法同時檢測雞肉和雞蛋中多獸藥殘留對雞肉和雞蛋類食品的食用安全性以及對其日常的監管具有重要意義。

獸藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法［9］、氣相色譜-串聯質譜法［10-11］、液相色譜法［12］、超高效液相色譜-串聯質譜法［13-16］等，其中超高效液相色譜-串聯質譜法是目前最為常用的方法。現有方法普遍存在問題是大多前處理需要對樣品進行液-液萃取、固相萃取柱凈化，部分方法需要進行衍生化，過程繁瑣操作復雜、耗時長而且會消耗大量有機試劑，不適合大通量樣品篩查。本研究采用Waters PRIME HLB固相萃取柱凈化，無需活化平衡，前處理過程簡單，試劑消耗量小，省時省力，經濟節約。既保證了檢驗的準確度，又提高了工作效率。

本研究選取了日常檢測中風險較高的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等9種藥物，建立一種適合雞肉和雞蛋中多獸藥殘留同時分析的檢測方法，以期為食品安全監測提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備

LC-30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司）；QTRAP 5500三重四極桿液相色譜質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）；Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph公司）；KQ5200E超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；3-30KS離心機（德國Sigma公司）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特賽恩儀器有限公司）；XS 204電子分析天平（瑞士Mettler-To‐ledo公司）；Milli-Q超純水制備系統（德國默克公司）。

1.1.2 標準品

氯霉素（1 000 μg/mL）、氯霉素-D5（100 μg/mL）、甲砜霉素（100 μg/mL）、氟苯尼考（1 000 μg/mL）、金剛烷胺（100 μg/mL）、金剛乙胺（100 μg/mL）、恩諾沙星（100 μg/mL）、環丙沙星（1 000 μg/mL）、氧氟沙星（1 000 μg/mL）、諾氟沙星（100 μg/mL）（阿 爾 塔公司）。

1.1.3 試劑耗材

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙酸銨（色譜純，美國ThermoFisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，上海aladdin公司）；Waters Oasis PRIME HLB固 相 萃 取 柱（200 mg/6 mL，美 國Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確吸取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星標準品適量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

混合標準工作液（1 μg/mL）：準確吸取混合標準中間液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

同位素內標中間液（1 μg/mL）：準確吸取氯霉素-D5標準溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

同位素內標工作液（100 ng/mL）：準確吸取同位素內標中間液1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品處理

稱取經均質樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入100 μL同位素內標工作液和10 mL含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液，漩渦混勻2 min，置于超聲波清洗器中超聲提取10 min，9 000 r/min離心5 min。無需活化平衡，將全部提取液加載到PRIME HLB固相萃取柱，樣液在重力作用下過柱，收集全部流出液。在40°C下氮氣吹至近干，用含0.1%甲酸的乙腈水（10∶90，V∶V）溶解定容至1 mL，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾，上LC-MS/MS測定。

1.2.3 儀器分析條件

1.2.3.1 液相色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），美國Waters公司；柱溫：40°C；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL。流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫梯度

1.2.3.2 質譜條件

電噴霧電離源（ESI）；電噴霧電壓（ESI-）：-4 500 V；電噴霧電壓（ESI+）：5 500 V；離子源溫度：550°C；霧化氣（GS1）：55 psi；加熱氣（GS2）：55 psi；氣簾氣（CUR）：30 psi；多反應監測模式（MRM）。其它質譜參數見表2。

表2 質譜分析參數

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

本研究選取Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Agilent XDB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）等3種不同型號色譜柱進行分離研究。結果表明，在同等色譜條件下，9種化合物在Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱上的色譜峰形最好，分離度最佳。因此選擇Waters Acquity UPLC BEH C18柱進行測定。

2.1.2 流動相的選擇

為了提高化合物的離子化效率，提高響應值以及改善化合物峰形，本研究比較了水/甲醇、水/乙腈、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）/乙腈等流動相體系對目標化合物的影響。研究發現，當流動相為水/甲醇或水/乙腈時部分目標物峰展寬，響應值相對較低；流動相加入甲酸后，增加了目標化合物的電離效率，響應值普遍增大；流動相加入乙酸銨后部分化合物峰形得到改善，但有部分化合物響應值降低，綜合考慮選取0.1%甲酸水/乙腈為流動相。通過優化流動相梯度洗脫程序，9種目標化合物達到較好分離，色譜峰峰型良好。各目標化合物定量離子對提取質譜圖見圖1。

圖1 九種獸藥定量離子對提取質譜圖

2.2 樣品處理的優化

2.2.1 提取溶液的選擇

雞肉和雞蛋中含有大量的蛋白質、脂肪及磷脂類［16-17］，干擾目標化合物的分析，因此需要選擇合適的提取試劑以達到既能排除干擾，又能充分提取目標化合物的目的。本研究首先比較了甲醇、乙腈和乙酸乙酯對雞肉基質的提取效果。研究表明，用甲醇提取回收率較低，乙酸乙酯提取基質干擾較大，用乙腈提取沉淀蛋白的效果好，回收率高且重復性較好。用同樣的方法對雞蛋進行試驗，發現乙腈的提取效果最好，因此選擇乙腈作為提取液進行進一步研究。試驗分別比較了70%、80%、90%乙腈水溶液及純乙腈溶液的提取效率和凈化效果，同時根據李明［18］、劉新輝［19］等研究比較了加入0.2%甲酸對提取效率的影響。結果發現70%乙腈水溶液提取時提取液渾濁，過PRIME HLB固相萃取柱困難且回收率低，90%乙腈水溶液和純乙腈提取時部分化合物基質干擾影響較大，80%乙腈水溶液提取基質干擾較小，回收率較高。加入甲酸后提取效率普遍增高，含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液能同時兼顧9種不同化合物的提取效率。以雞肉中金剛烷胺為例，見圖2。

圖2 不同提取溶劑對雞肉中金剛烷胺的影響

續圖1九種獸藥定量離子對提取質譜圖

2.2.2 固相萃取柱的選擇

本研究比較了HLB柱、MCX柱和PRIME HLB柱的凈化效果。按照1.2.2進行加標回收試驗，采用上述3種凈化柱凈化。對比發現經HLB柱和MCX柱凈化后樣品的回收偏低，平行樣品間相對偏差較大。經PRIME HLB柱凈化后樣品基質干擾較小，9種化合物回收率高且穩定，而且PRIME HLB柱是一種雜質吸附型固相萃取柱，能有效去除雞蛋和雞肉中脂肪和磷脂［20］，無需活化平衡，操作簡便，減少有機試劑的使用，綜合考慮選擇PRIME HLB柱作為凈化柱。

2.3 標準曲線和檢出限

用按照1.2.2處理得到的陰性樣品處理液，將混合標準工作液配制成質量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的混合標準曲線工作液，同位素內標濃度為10 ng/mL進行上機測定。以目標化合物濃度為橫坐標，定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。9種目標化合物均呈現較好的線性關系，相關系數r均大于0.997，見表3。按照信噪比的3倍（S/N＝3）和10倍（S/N＝10）分別對應目標化合物濃度作為檢出限和定量限的規則，9種目標化合物的檢出限為0.05 μg/kg，定 量 限 為0.5 μg/kg，低 于GB/T 20756—2006［21］、GB/T 20366—2006［22］等 國家 標準檢出限和定量限的要求。

表3 九種目標化合物的線性關系、檢出限、定量限

2.4 回收率和精密度

分別在陰性樣品中添加低、中、高3個濃度水平的9種混合標準使用液，每個水平做6個平行樣，根據1.2.2方法進行前處理，平均回收率為74.6%～119.1%，RSD范圍為0.9%～7.6%，見表4，說明本方法回收率及精密度較好。

表4 九種目標化合物的回收率及相對標準偏差（n=6）

2.5 實際樣品檢測

采用上述方法檢測本市農貿市場隨機抽取的5份雞肉樣品和20份雞蛋樣品。其中一份雞蛋樣品檢測出恩諾沙星，檢測值為7.7 μg/kg，其余樣品均未檢測出上述9種藥物。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定雞肉和雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等獸藥殘留量的方法。優化了色譜條件、質譜條件、樣品前處理方法和樣品凈化方式。本方法檢出限低，回收率高、精密度好，為同時檢測雞肉和雞蛋中多獸藥殘留提供了一種便捷可靠的方法，能夠滿足檢驗檢測機構日常樣品篩查和研究的需要。