基于網絡藥理學分析真武湯治療類風濕關節炎的作用機制▲

熊海風 劉若雅 李任城 楊 博 黎啟航 占華松 楊 淵

(1 廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧 530001，電子郵箱：496095683@qq.com；2 廣西醫大開元埌東醫院骨科，廣西南寧 530021)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性關節炎癥為特征，導致軟骨破壞、骨侵蝕甚至殘疾的慢性自身免疫性疾病[1]。目前，本病的確切病因以及病理機制仍未明確，研究表明多種遺傳因素和環境因素作用于關節滑膜、軟骨、關節囊等部位，可導致關節腔內炎性反應，從而引起RA及其一系列并發癥的發生[2]。RA的主要臨床癥狀包括關節疼痛、腫脹、功能受限，此外，還可出現明顯的晨僵和類似增生性關節病的關節僵硬現象。西醫中，RA的總治療目標是完全緩解(至少顯著降低疾病活動性)時間控制在6個月以內，以預防關節損傷、殘疾和全身表現[3]。為達到此目的，一般選擇糖皮質激素、改善病情抗風濕藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、生物制劑等藥物治療[4-7]。但這些藥物各有缺點：糖皮質激素療效最差，且副作用眾多[8]；DMARDs所引起的不良反應大[5]；NSAIDs則只能減輕疼痛和腫脹并改善關節功能，但不能防止額外的關節損傷，對疾病無治愈效果[6];生物制劑[7]價格昂貴，且副作用較多。因此，急需尋求新的方法治療RA。

祖國中醫藥傳承歷史悠久，對于臨床上多種疑難雜癥的治療頗有療效，且具有治療費用低和毒副作用較小等優點，故利用中醫藥辨證論治RA是一條可探尋之路[9]。根據RA的致病特點，祖國中醫藥將其歸類為“尪痹”范疇[10]，其中“尪”始出于張仲景所著《金匱要略》“中風歷節病篇”中所言的歷節病，“諸肢節疼痛，身體尪羸”。《辭源》為其注曰： “骨骼彎曲癥，脛、背、胸彎曲都叫尪。”“痹”即痹病。因此，“尪痹”指具有關節疼痛、變形、僵硬、屈伸不利以及肌肉萎縮等癥狀的痹病。根據不同病因病機及臨床癥狀，RA可以分為腎虛寒侵、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、瘀血阻絡等不同證型。根據不同證型，遣方用藥也不盡相同，其中真武湯亦是治療尪痹的經典方劑之一。真武湯見于張仲景所著《傷寒雜病論》，具有溫陽利水之功效，故可治療RA中屬腎虛寒侵之證者。然而，真武湯治療RA的作用機制尚不明確。故本研究利用網絡藥理學方法，對真武湯治療RA的主要成分、靶點、通路進行分析，進而預測真武湯治療RA的藥理作用機制，旨在為臨床治療RA提供新的思路與方向。

1 資料與方法

1.1 真武湯有效化學成分與作用靶點的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(https://tcmspw.com/news.php)對真武湯中的茯苓、白芍、生姜、附子、白術5種中藥進行檢索，以藥物口服利用度≥30%、類 藥 性≥0.18作為篩選條件，篩選出5種中藥的化學成分。將得到的化學成分通過DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)進行靶點預測，刪除無法預測到作用靶點的化學成分，保留有效化學成分及其靶點。在UniProt數據庫(https://sparql.uniprot.org/)中，設定“Human”及“Reviewed”為篩選條件，獲取靶點對應的基因名稱文件，最后通過Perl軟件(https://www.perl.org/)將預測靶點與基因名稱建立聯系。

1.2 真武湯有效化學成分-藥物靶點基因網絡的構建 為方便作圖，將篩選出的有效化學成分以拼音首字母和數字為組合進行編號，將篩選得到的有效化學成分編號與藥物靶點基因導入Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/)中，構建出有效化學成分-靶點基因網絡；然后使用網絡中Network Analyzer工具進行網絡拓撲結構分析，通過設置節點的度值(Degree)大小與節點圖形大小呈正相關來體現節點在網絡中的重要程度(而圖形中Degree越大，則節點圖形越大)。

1.3 RA相關疾病靶點的預測 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中檢索“Rheumatoid Arthritis”，收集與RA相關的疾病靶點基因，通過Relevance score值大小(中位數以上)作為篩選條件，去除冗雜，篩選出相關度更高的靶點基因。

1.4 藥物-疾病共同靶點的確定及蛋白-蛋白互作網絡的構建 通過R語言4.0.0版(https://www.r-project.org/)將真武湯藥物靶點基因與RA疾病靶點基因取交集，并構建Venn圖，其中交集的靶點基因可能是真武湯中藥物治療RA的關鍵靶點。將交集靶點基因導入Cytoscape軟件，構建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡，并以網絡度(degree)值>61、介數(betweenness)值>2100作為篩選條件，得到核心網絡。

1.5 功能富集分析與通路富集分析 運用R語言及DAVID數據平臺(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的交集靶點基因進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(設定P<0.05，Q<0.05)，進一步分析真武湯治療RA的潛在作用機制。

1.6 構建KEGG關系網絡 運用Cytoscape軟件構建KEGG關系網絡，然后使用Network Analyzer工具進行網絡拓撲結構分析，從而使關系網絡更數據化，并通過設置節點的Degree值大小與節點圖形大小成正相關來體現節點在網絡中的重要程度。

2 結 果

2.1 真武湯的有效化學成分及其對應靶點 針對真武湯5味中藥，共檢索出61個化學成分，其中茯苓15個、白芍13個、生姜5個、附子21個、白術7個。其中有36個化學成分未找到相關作用靶點，故去除。最終獲得23個有效化學成分(茯苓6個、白芍8個、生姜1個、附子6個、白術4個，其中附子/白芍、生姜/白芍各重疊1個)，見表1。23個有效化學成分對應244個相關靶點，通過UniProt數據庫和Perl軟件，找到靶點對應的基因名稱并建立聯系，去除重復項后共獲得對應靶點基因85個。

2.2 真武湯有效化學成分-藥物靶點基因的網絡圖 將有效化學成分進行編號后，利用Cytoscape軟件構建有效化學成分-靶點基因網絡，見圖1。該網絡共包括115個節點和297個相互關系，根據Degree值，排名前5位的化合物分別是β-谷甾醇(MOL000358)、山柰酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000296)、3β-乙酰氧基蒼術酮(MOL000049)、石防風素(MOL002392)，見表1。

表1 真武湯有效成分信息

圖1 真武湯有效化學成分-靶點基因網絡

2.3 RA相關的疾病靶點基因及交集靶點基因的PPI網絡 共獲得RA相關的疾病靶點基因1089個。將1089個疾病靶點基因與真武湯有效化學成分的靶點基因通過R語言繪制Venn圖(見圖2),獲得43個交集靶點基因，可能是真武湯治療 RA的關鍵靶點基因。將交集靶點基因導入Cytoscape軟件分析后得到PPI網絡，然后篩選出核心網絡，見圖3。其中Degree值排名較前的靶點基因為熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)90AA1、雌激素受體1、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)、雄性激素受體、轉錄因子P65等。

圖2 Venn圖

圖3 交集靶點基因的PPI網絡及核心網絡

2.4 交集靶點基因的GO富集分析 運用R語言及DAVID數據平臺對獲得的交集靶點基因進行GO富集分析，根據每條項目的P值及基因數的不同，以P值及關聯基因數升序排列，對其進行可視化處理，獲得GO分析氣泡圖，見圖4。結果顯示，在生物過程中確定有841個GO條目，主要富集在對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對營養水平的反應、對抗生素的反應等生物過程中。

圖4 交集靶點基因的GO分析氣泡圖

2.5 交集靶點基因的KEGG通路富集分析 運用R語言及DAVID數據平臺對獲得的交集靶點基因進行KEGG通路富集分析，根據每條通路上富集基因數目及顯著性的不同，以基因數目及顯著性升序排列，對其進行可視化處理，獲得KEGG富集分析氣泡圖。顯著性表現為：P值越小，顯著性越高(顏色越紅)；關聯基因數與GO上總基因數的比值越大，顯著性越高(x軸值越大)。見圖5。結果共獲得107條通路，主要富集在流體剪切應力和動脈粥樣硬化、在糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGE)-AGE受體(receptor of AGE,RAGE)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細胞介素(interleukin,IL)-17等信號通路，而圖5顯示的其他重要信號通路，無大量文獻支持其與RA的相關性。所建立的KEGG關系網絡中共有45個節點、203個相互關系(見圖6)，從圖中可看出，1條 KEGG通路往往可以富集到多個靶點基因，而1個靶點基因同時又可以出現在多條通路中。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

圖6 KEGG關系網絡

3 討 論

真武湯由茯苓、白芍、生姜、附子、白術5味中藥組成，是溫陽利水的經典方劑[11]，可有效治療腎虛寒侵之證的RA。現代藥理學研究表明，茯苓具有抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗氧化、抗衰老的作用[12]，白術具有抗腫瘤、抗炎的作用[13]，白芍具有免疫調節、抗炎的作用[14]，附子具有抗腫瘤、鎮痛、抗炎等作用[15]，生姜具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[16]。盡管現代藥理學對真武湯中的5味中藥已經有了較為深入的研究，但是其治療RA的具體作用機制鮮有研究報告。

本研究結果顯示，真武湯的有效化學成分中，節點的Degree值位列前5的為β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、3β-乙酰氧基蒼術酮、石防風素。其中，β-谷甾醇可以減少血管內的一氧化氮，并促進細胞鈣的攝取，以此抑制巨噬細胞生成IL-6、髓過氧化物酶、腺苷脫氨酶，從而抑制IL-1β、TNF-α等炎性因子的分泌，最終發揮抗炎效果[17-18]。山柰酚可通過增加S期細胞數量以改變細胞的周期，從而介導細胞的凋亡，發揮其免疫調節、疾病預防方面的作用；同時，其可以通過促進成骨細胞的增殖和分化，以及降低抗酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K的活力，抑制骨吸收，達到抗骨質疏松的作用；此外，山奈酚還有抗炎、抗氧化、降血糖、對損傷組織的保護等作用[19-20]。木犀草素具有體內外同時抗炎的作用[21]，其抗炎作用是通過多個途徑來發揮的，主要包括抑制活性氧及一氧化氮的生成[22]，調節IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、IL-10等炎性因子及炎性介質水平[23]，影響核因子κB、 激活蛋白1、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等信號通路[24-26]。而3β-乙酰氧基蒼術酮及石防風素的作用則少有相關研究報告。因此，β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等成分可能在真武湯治療RA的過程中發揮較為重要的作用。

在對藥物靶點基因及疾病靶點基因的交集基因進行PPI分析后，發現其中Degree值排名較前的靶點基因為HSP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄性激素受體、轉錄因子P65等。HSP90AA1可編碼合成HSP90α，而HSP90α作為HSP90的亞型，除了在細胞內發揮作用外，還在傷口愈合和炎癥中發揮分泌細胞外因子的作用。細胞外的HSP90α通過激活核因子κB和STAT3轉錄程序(包括促炎細胞因子IL-6和IL-8)，從而起到誘導炎癥的作用[27]。VCAM1可增加白細胞與內皮細胞的黏附性，并為其遷入內皮下參與病理過程創造條件[28]。性激素在免疫反應及局部炎癥反應中扮演著重要角色，其中雌激素可促進B淋巴細胞增加、協同促進T淋巴細胞的增加，以此加強免疫能力[29]；并且可通過降低如IL-1β、IL-6等炎性介質水平，達到抑制炎癥的作用[30]。轉錄因子P65是核因子κB的亞基之一，其與P50共同組成核因子κB，而核因子κB是在RA患者中高表達的活化因子[31]，參與RA病程中的滑膜細胞增殖凋亡、炎性細胞因子的啟動、免疫系統的調節[32-34]。由此可見，真武湯可能是通過調節HSP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄激素受體1、轉錄因子P65等靶點基因來達到治療RA的效果。

KEGG通路富集分析結果顯示，交集靶點基因主要富集在流體剪切應力和動脈粥樣硬化、在糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等。RA的炎癥反應會使IL-6、IL-1、TNF-α等促炎癥細胞因子釋放進血液循環系統中，再進入內皮組織中，從而引發血管內皮細胞的黏附，導致動脈粥樣硬化等一系列心血管疾病[35]。流體剪切應力是內皮細胞接受的最主要力學刺激，通過改善流體剪切應力可保護內皮組織，從而減少血管內皮細胞的黏附并改善動脈粥樣硬化[36]；同時，流體剪切應力可通過激活Wnt信號通路、細胞外信號調節激酶5信號通路等來達到促進骨細胞增殖分化及抑制骨細胞凋亡的作用[37-38]。而AGE與RAGE的相互作用是糖尿病并發癥發生的最主要原因之一[39]。其中RAGE是細胞表面分子免疫球蛋白超家族的成員之一，其作為促炎性介質在炎癥反應中起作用，AGE與RAGE相互作用后，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶或核因子κB來上調IL-1β和TNF-α等炎性介質水平，從而引起炎癥反應[39-40]。TNF信號通路和IL-17信號通路與RA的炎癥反應有密切聯系[41]，且已有大量研究證明，本文不再贅述。此外，GO富集分析結果顯示，真武湯治療RA主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對營養水平的反應、對抗生素的反應等生物過程。現有研究顯示，脂多糖是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，其可作為生物效應器刺激宿主對細菌感染發生反應，免疫刺激作用較強；脂多糖可與位于細胞表面的Toll樣受體4結合，當Toll樣受體4識別脂多糖后，會刺激受體相關激酶及核因子κB，后者會上調炎性介質水平，進而引發炎癥反應[42]。且有學者指出，RA患者對脂多糖的刺激敏感性增加，認為脂多糖可能在誘發RA發生的過程中起到重要作用[43]。由此推測，真武湯可能是通過改變流體剪切應力以保護內皮細胞、抑制炎癥反應、調節免疫能力來發揮治療RA的作用。

綜上所述，真武湯可能是通過調節HSP90AA1、雌激素受體1、VCAM1、雄激素受體、轉錄因子P65等靶點基因，調控糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等通路，從而保護內皮細胞、抑制炎癥反應及調節免疫能力來治療RA。這體現真武湯多成分、多靶點、多途徑相互協同發揮作用的特點。但是受限于各平臺數據庫及軟件功能，本研究仍有很多不足之處，故得到的結果還有待進一步實驗研究的驗證。