黃芩苷對人皮膚惡性黑素瘤A875細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響▲

肖 敏 徐洪來

(廣西柳州市人民醫(yī)院1 皮膚科，2 肝膽外科，柳州市 545006，電子郵箱：501880191@qq.com)

惡性黑素瘤來源于黑素細胞，在皮膚腫瘤中惡性度極高，是致死率最高的一種皮膚惡性腫瘤。近年來，惡性黑素瘤的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢[1]。惡性黑素瘤的發(fā)病病因和機制尚不十分清楚，目前被認為與長期日光照射、病毒感染、種族、機體免疫功能低下、外傷等多種因素密切相關[2]。對于未轉移的黑素瘤，手術切除是主要的治療手段，患者存活率可達到80%以上[3]。但由于惡性黑素瘤細胞可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，易向遠處擴散，發(fā)生轉移早，多數(shù)患者就診時已發(fā)生遠處轉移，因此無法通過手術完全切除[4]。晚期轉移性黑素瘤患者則需要接受其他方法進行治療，如化療、放療、免疫治療和靶向治療等，但預后不佳，且化療藥物的毒副作用大[5]。因此，尋找安全有效的抗惡性黑素瘤藥物是當前的研究熱點。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗腫瘤作用，對舌癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制效果[6]。但黃芩苷對惡性黑素瘤的抗腫瘤作用還鮮有報告。本研究探討不同濃度的黃芩苷對人皮膚惡性黑素瘤A875細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其可能機制，為臨床治療惡性黑素瘤提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚惡性黑素瘤A875細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所細胞中心；黃芩苷(批號:21967-41-9)購自南京源植生物科技有限公司，使用時用生理鹽水溶解配比；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：SH30809.01B)和胎牛血清(批號：021-60348065)購自美國HyClone公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3(批號:ab44976)、Caspase-9(批號:ab52298)、細胞周期蛋白(Cyclin) D1抗體(批號:ab16663)和β-肌動蛋白(β-actin，批號：ab13772)購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(批號:ZF.0311)購自北京中彬金橋生物技術有限公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(批號：G4101-1000T)購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將A875細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔1 d更換1次培養(yǎng)液，胰蛋白酶進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞分組：將對數(shù)生長期的A875細胞分為對照組和實驗組，其中實驗組又分為80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組。

1.2.3 MTT法檢測A875細胞增殖情況：將A875細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，密度為1×104個/孔，按1.2.2方法將細胞分組，每組設6個平行孔。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實驗組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)，對照組加入等體積培養(yǎng)基。繼續(xù)在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)48 h、72 h。終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，更換不含黃芩苷的新鮮無血清RPMI 1640培養(yǎng)基。每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內液體，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min使結晶充分溶解，于酶標儀570 nm波長處測定各孔光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(OD實驗組/OD對照組)×100%。實驗重復3次。

1.2.4 細胞克隆形成實驗觀察細胞克隆形成能力：調整A875細胞密度為200個/孔并接種于6孔板中，按1.2.2方法將細胞分組，每組設6個平行孔。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實驗組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對照組加入等體積培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，其間每隔2 d換液一次(吸除舊培養(yǎng)基，加入新鮮等濃度培養(yǎng)基)。吸除培養(yǎng)板內培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗 2 次，1 min/次，4%多聚甲醛固定細胞30 min。吸除固定液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，1 min/次，加入0.1%結晶紫溶液染色30 min。去除染色液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，1 min/次，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。以超過50個細胞的細胞團作為一個細胞克隆，計數(shù)細胞克隆形成個數(shù)，以細胞克隆形成個數(shù)表示細胞克隆形成能力。 實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率：取對數(shù)生長期的A875細胞，胰蛋白酶消化細胞后制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，以1 mL/孔接種于6孔板中，按1.2.2方法將細胞分組，每組設6個平行孔。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實驗組各亞組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對照組加入等體積培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸除上清液，收集細胞并用冷磷酸緩沖鹽溶液清洗細胞2次，1 min/次，再用1×結合緩沖液重懸細胞，取100 μL細胞懸液加入5 mL培養(yǎng)管中，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和5 μL 碘化丙啶，混勻后室溫下避光孵育15 min，各實驗管中再分別加入1×結合緩沖液400 μL。1 h內上流式細胞儀測定細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞周期：取對數(shù)生長期的A875細胞以1×106個/孔接種于6孔板中，按1.2.2方法將細胞分組，每組設6個平行孔。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，實驗組各亞組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細胞并用預冷磷酸緩沖鹽溶液 充分洗滌2次，1 min/次，加入75%乙醇固定，4℃靜置24 h，預冷磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，1 min/次，加入20 μL RNase 37 ℃水浴消化30 min，加入0.5 mL 碘化丙啶室溫下避光染色30 min，24 h內上流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測A875細胞Caspase-3、Caspase-9、Cyclin D1蛋白表達水平：將對數(shù)生長期的A875細胞制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，以1 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁，將細胞分為對照組和320 μg/mL黃芩苷組，分別加入含0 μg/mL和320 μg/mL黃芩苷的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每組設6個平行孔。收集細胞，磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，1 min/次，加入RIPA裂解液裂解細胞，用蛋白提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，批號：YT8951)提取細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。將含有等量蛋白的樣品用上樣緩沖液稀釋，置于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(分離膠15%、濃縮膠5%)行電泳分離蛋白，電泳結束后轉膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h；分別加入Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、β-肌動蛋白一抗(1 ∶1 000)，4℃ 過夜；加堿性磷酸酶標記的二抗(1 ∶500)，37℃孵育1 h后，用堿性磷酸酶顯色液顯色后掃描成像。以β-肌動蛋白為內參照，計算Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白相對表達水平。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度黃芩苷對A875細胞存活率的影響 隨著黃芩苷藥物濃度的升高和作用時間延長，A875細胞的細胞存活率逐漸下降 (均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度黃芩苷對A875細胞存活率的影響(x±s， %)

2.2 各組細胞克隆形成能力的比較 對照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組，細胞克隆形成個數(shù)依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度黃芩苷對A875細胞克隆形成能力的影響(x±s，個)

2.3 各組細胞凋亡率的比較 對照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組A875細胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度黃芩苷對A875細胞凋亡率的影響(x±s，%)

2.4 各組細胞周期細胞比例的比較 對照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組G0/G1期細胞比例依次升高，S期細胞比例依次下降(P<0.05)，除對照組、80 μg/mL黃芩苷組G2/M期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余黃芩苷濃度組之間及其與對照組比較，G2/M期細胞比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞周期細胞比例的比較(x±s,%)

2.5 各組A875細胞Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表達水平的比較 選取實驗中黃芩苷最高濃度組320 μg/mL進行實驗，與對照組比較，320 μg/mL黃芩苷組A875細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平升高， CyclinD1蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞 Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表達水平的比較(x±s)

3 討 論

黃芩在我國產量大，用藥歷史悠久，其副作用小，毒性低，價格低廉，因此用途廣泛。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，黃芩的功效為清熱除濕、瀉火解毒。黃芩苷是黃芩最有效的化學成分之一，在臨床上主要用于治療心血管疾病、腦缺血、肝炎、肺炎、抗感染等[7]。隨著對黃芩苷分子機制研究的逐步深入，學者們發(fā)現(xiàn)黃芩苷還具有抗腫瘤作用，近年來的研究顯示，黃芩苷對舌癌、食管癌、骨肉瘤、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞的增殖具有抑制作用，并能誘導腫瘤細胞凋亡[8]。

生物體內細胞的增殖和細胞的死亡之間存在著動態(tài)平衡，使多細胞生物個體能夠正常生長發(fā)育[9]。細胞無限增殖和細胞死亡抑制，是惡性腫瘤的兩大顯著特征[10]。細胞失控性增殖的原因包括：細胞快速生長和分裂，細胞周期調控紊亂，細胞凋亡減少。細胞周期是指細胞從一次分裂完成的開始，到下一次分裂結束。細胞周期是一種復雜且精細的調節(jié)過程，嚴格按照 G1-S-G2-M 循環(huán)運轉[11]。細胞通過細胞周期的調控，實現(xiàn)自我更新及個體發(fā)育。細胞周期是保證細胞正常生命活動的過程[12]。Cyclin、細胞周期蛋白依賴性激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑三者共同協(xié)調完成對細胞周期的調控[13]。Cyclin可分為多種類型，其中CyclinD1推動細胞周期從G1期進入S期，導致細胞增殖[14]。在絕大多數(shù)腫瘤細胞中，Cyclin存在著異常激活的現(xiàn)象[15]。因此，細胞周期活動異常，促使細胞持續(xù)增殖，是腫瘤細胞的特點。本研究結果顯示，不同濃度黃芩苷干預A875細胞48 h、72 h后，隨著黃芩苷藥物濃度的升高和作用時間的延長，A875細胞的存活率逐漸下降；不同濃度黃芩苷干預A875細胞7 d后，各組細胞克隆個數(shù)隨著黃芩苷藥物濃度的升高而下降(P<0.05)。均表明黃芩苷能抑制A875細胞的增殖，且隨著藥物濃度的增加和藥物作用時間的延長，抑制增殖作用增強，呈現(xiàn)明顯的濃度與時間相關性。此外，黃芩苷作用于A875細胞后G0/G1期細胞比例明顯上升，S期和G2/M期比例明顯下降，且給予320 μg/mL黃芩苷干預后，A875細胞中CyclinD1蛋白表達水平降低，表明黃芩苷可將A875細胞阻滯于G0/G1期，特異性抑制細胞分裂。

細胞凋亡是指由于細胞內外的因素，觸發(fā)細胞內預存的死亡程序，在基因的調控下自主地死亡，有序結束生命的過程，即程序性細胞死亡[16]。細胞凋亡常出現(xiàn)細胞收縮、出芽小體形成、細胞核固縮、染色質裂解等形態(tài)學的變化。細胞凋亡可以清除不良細胞，維持組織內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[17]。細胞凋亡的信號通路包括內源性凋亡途徑、外源性凋亡途徑和內質網相關的凋亡途徑[18]。Caspase家族貫穿于細胞凋亡的各個時期，在細胞凋亡中起到了關鍵作用[19]。在內源性凋亡途徑中，細胞受到外界凋亡信號的刺激,線粒體膜發(fā)生腫脹，通透性增高，Cyto-C、PDCD8、Bitl等凋亡啟動因子從線粒體轉移至胞質，與Caspase-9及凋亡酶激活因子1結合，形成凋亡體，激活Caspase-9，進一步激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 等因子，從而啟動細胞凋亡程序[20]。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的效應因子，是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，它的活化標志著凋亡進入不可逆的階段[21]。細胞的凋亡，負調控著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。促使細胞周期停滯和細胞凋亡，是治療惡性腫瘤的一種靶向方法[23]。本研究結果顯示，給予320 μg/mL黃芩苷干預后，細胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表達水平均升高，提示黃芩苷可誘導A875細胞凋亡，促進Caspase-3、Caspase-9蛋白表達。

綜上所述，黃芩苷可以抑制A875細胞增殖，并誘導其凋亡，將A875細胞阻滯于G0/G1期，抑制細胞分裂，機制可能與黃芩苷升高Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平，降低CyclinD1蛋白表達水平有關。