玉郎傘查耳酮下調Cav1.2和RyR2表達抑制氧化應激所致心肌鈣超載的效果及作用機制▲

蒙湄方 蘇延旭 馬興菊 何 陽 黃仁彬 李映新

(1 廣西醫科大學藥學院，南寧市 530021，電子郵箱:1628936259@qq.com；2 廣西醫科大學第二附屬醫院藥劑科，南寧市 530007；3 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥劑科，南寧市 530011)

玉郎傘為蝶形花科植物疏葉崖豆的干燥塊根，廣西壯族居民常將其用于治療原發性高血壓、跌打損傷、老年癡呆及產后體虛等[1]。現代藥理學研究顯示，玉郎傘的主要有效成分為黃酮及多糖，其功效主要包括保肝、降糖、抗腫瘤、抗心肌缺血、提高免疫力等[2]。目前，中藥單體的藥理藥效是研究的熱點領域，研究表明，從玉郎傘的總黃酮中提取的17-甲氧基-7-羥基-苯駢呋喃查爾酮[簡稱玉郎傘查耳酮(Yulangsanchalcone,YLSC)]可以通過抗氧化應激以及抑制細胞凋亡和過度自噬，發揮保護心肌缺血再灌注損傷的作用[4-6]。

目前認為，再灌注后氧化應激所致的心肌細胞鈣超載是造成心肌損傷不可逆轉的重要因素，因此減輕鈣超載保護心肌缺血再灌注損傷成為以鈣轉運和鈣依賴蛋白為干預靶點的藥物研究的新思路。本研究主要分析YLSC對過氧化氫引起的心肌細胞內游離鈣離子增加的干預作用，并通過測定鈣離子通道Cav1.2和雷諾定受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)的mRNA表達，初步探討YLSC抗心肌缺血再灌注的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD乳鼠10只，由廣西醫科大學動物實驗中心提供[動物生產許可證：SYKG(桂)2009-0003；動物使用許可證：SYKG(桂)2009-0005]， 1～3日齡。

1.2 藥品和試劑 玉郎傘采自廣西靈山縣，經廣西醫科大學生藥教研室鑒定為蝶形花科植物疏葉崖豆的干燥塊根，參照相關文獻[3]中的方法提取YLSC(高效液相色譜法檢測，含量≥98%)。杜氏改良伊戈爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)-F12、牛血清白蛋白均購自Gibico公司，胎牛血清購自HyClone公司，鈣離子熒光探針Fluo-3AM、Pluronic F-127、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)均購自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶購自索萊寶公司，總RNA 提取試劑 RNAiso Plus、反轉錄試劑和SYBR Green Mix 購自大連TaKaRa 公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest 公司，上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 主要儀器 YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；250型CO2培養箱(美國SHEL-LAB公司)；FV1000型激光掃描共聚焦系統(日本Olympus公司)；7300型實時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)；PowerPac Basic基礎電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 心肌細胞的培養 參照文獻[7]改進培養方法。無菌條件下取乳鼠心尖組織于HEPES緩沖液中剪碎，加入37 ℃胰酶(0.1%)約10 mL，輕柔吹打消化6～7次(8 min/次)，除第1次消化液棄去外，收集其余消化液并加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養液終止消化；將所收集消化液用200目篩過濾，4℃下800 r/min 離心5 min，取下層沉淀細胞重懸于培養液中，置于CO2培養箱(5% CO2、95% O2)中37℃下培養1 h后，采用差速貼壁培養法純化心肌細胞；培養液中加入終濃度為0.1 mmol/L 的BrdU繼續培養3～4 d，待細胞融合成片，90%以上細胞有節律同步搏動時用于后續實驗。

1.5 氧化損傷模型的建立及細胞內游離鈣離子濃度的測定 將心肌細胞隨機分為對照組、模型組、100 μmol/L YLSC預處理組和200 μmol/L YLSC預處理組。對照組和模型組加入無血清培養基，YLSC預處理組于無血清培養基中分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L的YLSC，每組設3個平行。各組于培養箱中孵育24 h后棄去培養液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞3次，加入含5 μmol/L的Fluo-3AM和0.1% Pluronic F-127的磷酸緩沖鹽溶負載液，37℃避光溫育45 min，用磷酸緩沖鹽溶漂洗2～3次，棄去液體，加入無血清低糖DMEM培養液于培養箱中孵育15 min。除對照組外，各組加入30%的過氧化氫溶液60 μL使其終濃度為0.3 mmol/L誘導氧化應激損傷，加入過氧化氫后即刻上機測定。用共聚焦激光掃描系統(激發波長488 nm，發射波長526 nm)每隔15 s 掃描1 次，選定細胞，記錄并采集圖像，每組選取3個視野動態檢測15 min。以平均熒光強度變化反映細胞內游離鈣離子的相對水平。實驗重復3次。

1.6 Cav1.2和RyR2 mRNA表達情況的檢測 細胞分組及預處理同1.5。各組細胞孵育24 h后，除對照組外，各組加入終濃度為0.3 mmol/L的過氧化氫孵育15 min后，按照試劑盒說明書分別提取各組細胞總RNA，以A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0間的合格RNA進行反轉錄。反轉錄及熒光定量PCR操作按照試劑盒說明進行：取總RNA 1 μg反轉錄為 cDNA，取等量的 cDNA用相應的引物以SYBR Green MIX熒光染料進行熒光定量PCR 擴增反應，各基因引物見表1，PCR反應體系包括SYBR Green MIX 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free H2O 6 μL。PCR反應條件按 PCR擴增和熔解曲線兩步法條件進行反應：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃ 15 s，72℃延伸15 s，共40個循環；最后進行產物熔解曲線測定，從60℃逐漸增溫到95℃，時間20 min，95℃ 15 s。以2%的瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物大小。所有PCR均重復3次，每次 3個平行樣本。采用2-ΔΔCt法分析各基因在細胞中的相對表達水平。

表1 引物序列

1.7 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，經方差齊性檢驗提示各組方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞內游離鈣離子 熒光強度的比較 加入過氧化氫即刻，細胞內游離鈣離子熒光強度升高，與對照組比較，其他3組15min內的游離鈣離子熒光強度均升高，模型組、YLSC低劑量預處理、高劑量預處理組的游離鈣離子熒光強度依次降低(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 4組心肌細胞內游離鈣離子熒光強度的比較(x±s)

圖1 4組心肌細胞內游離鈣離子熒光強度

2.2 各組心肌細胞 Cav1.2和RyR2的mRNA表達水平的比較 與對照組比較，模型組的Cav1.2和RyR2 mRNA表達水平均增加(P<0.05)；模型組、100 μmol/L YLSC預處理組、200 μmol/L YLSC預處理組的Cav1.2和RyR2 mRNA表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組心肌細胞Cav1.2和RyR2 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

鈣超載是缺血再灌注損傷的關鍵機制，鈣超載可引起線粒體膜電位降低、組織能量代謝障礙、胞質內磷脂酶和蛋白酶激活等一系列連鎖反應，最終導致細胞不可逆性損傷，故鈣超載又稱為缺血細胞再灌注損傷致死的“最后通路”[8]。氧化應激是引起鈣超載的常見因素，氧化性應激使胞內還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值下降，引起膜通道蛋白變構，使鈣離子內流增加，從而導致鈣超載[9]。過氧化氫可通過產生氧自由基引起細胞氧化應激損傷而導致鈣超載，故常用于模擬心肌缺血再灌注損傷及部分與氧自由基密切相關的心血管疾病病理模型[10]。

本研究采用過氧化氫誘導心肌細胞氧化應激損傷，利用Fluo-3AM與細胞內游離鈣離子特異性結合后能夠被激發熒光，可用激光掃描顯微鏡進行檢測的特點，對心肌細胞內游離鈣離子進行測定。結果顯示，過氧化氫處理后心肌細胞內的游離鈣離子濃度明顯升高，表明過氧化氫可以誘導氧化應激引起心肌細胞內鈣超載， YLSC預處理組加入過氧化氫后，游離鈣離子熒光強度雖然仍較對照組有所增加，但較模型組降低，且有劑量依賴性，說明玉郎傘查爾酮能對抗氧化應激引起的鈣超載。

心肌細胞內鈣離子濃度與外鈣的進入和內鈣的釋放有關，前者主要通過細胞膜上的L型鈣通道進入，后者主要是由肌質網上的RyR通道釋放，而心肌細胞上主要分布有RyR2。Cav1.2是心肌細胞L型鈣通道中構成鈣離子進入細胞的主要孔道結構。Cav1.2的表達升高可增加心肌細胞內的游離鈣離子濃度[11]，引發RyR2高親和位點與鈣離子結合，以“以鈣釋鈣”的方式促進鈣離子通過RyR2通道從肌漿網釋放到胞質中，且RyR2表達增加進一步引起細胞內游離鈣離子濃度的增加[12]。本實驗結果提示，過氧化氫處理能顯著增加心肌細胞L型鈣通道Cav1.2和RyR2 通道的mRNA表達量，而玉郎傘查耳酮預處理可下調過氧化氫引起的心肌細胞Cav1.2、RyR2的mRNA表達增加。由此推測， YLSC對抗氧化應激引起的鈣超載可能與下調過氧化氫引起的心肌細胞Cav1.2、RyR2的mRNA表達，從而減少外鈣的進入和內鈣的釋放有關。

綜上所述，YLSC預處理可抑制氧化應激引起的心肌鈣超載，其可能通過下調Cav1.2、RyR2的基因表達，從而抑制心肌細胞內游離鈣離子濃度增加。然而基因的表達水平和蛋白表達水平存在不完全一致的現象，因此，下一步還應對Cav1.2、RyR2的蛋白表達進行研究；此外，心肌細胞內的游離鈣離子濃度還受到鈉-鈣交換體、肌漿網鈣泵等功能的影響，今后也還需要進行相關研究，才能更好闡明 YLSC的作用機制。