靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質瘤細胞侵襲和遷移的影響*

王炳清， 馬慶波， 劉敬博， 高俊波

(北大醫療魯中醫院 神經外科， 山東 淄博 255400)

膠質瘤是一種常見的原發性顱內腫瘤，發病后患者表現出惡心嘔吐、頭痛、視覺模糊、癲癇等癥狀，嚴重時出現視覺喪失、肢體疼痛或麻木、肌力弱、運動與感覺障礙，臨床多給予患者手術聯合放化療，該病很難根治，術后復發率也較高[1-2]，預后不佳，因此探討其發生、發展的相關分子生物學機制和基因表達調節規律對于改善患者預后有著重要的意義[3-4]。Wnt/β連環蛋白信號通路(Wnt/β-catenin)是生物進化中調控細胞增殖、生長和凋亡的重要通路，其異常激活與腫瘤的發生和發展均密切相關[5]，推測干預該通路可幫助治療膠質瘤[6]。頭痛、頭風、真頭痛、厥逆等癥狀，中醫認為屬于外感六邪或內傷七情而致機體氣血陰陽失衡，郁結于腦內所致[7-8]；而中藥材靈芝性溫、味甘，具有補中益氣、扶正固本、滋補強壯的功效[9]，因此本文選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質瘤細胞株U251細胞，觀察對細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響，分析靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質瘤細胞侵襲和遷移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫內購入人膠質瘤細胞株U251。

1.1.2主要儀器及試劑 (dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜及Transwell小室購自美國Thermo Fisher公司，靈芝三萜(99%純度)購自杭州甫洛生物科技有限公司，Wnt/β-catenin通路的檢測試劑盒及相關試劑購自美國Sigma公司，兔抗人β-catenin多克隆體、兔抗人p-GSK-3β多克隆體購自英國Abcam公司；流式細胞儀購自美國BD公司，CO2培養箱購自日本SANYO公司，HBS-1096B酶標儀購自南京德鐵試驗設備公司。

1.2 方法

1.2.1分組及細胞培養 本研究將U251細胞分為4組：空白對照組未進行藥物處理，低、中、高劑量組分別給予10、50 及100 mg/L的靈芝三萜處理。將人膠質瘤U251細胞復蘇后接種于DMEM培養基內，內含10%FBS，于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，每2 d更換培養液1次，細胞密度達85%時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期期U251細胞接種至6孔板內，密度為1×109個/L，37 ℃培養箱內過夜，細胞貼壁后，采用10、50 及100 mg/L的靈芝三萜及等量的PBS分別處理U251細胞，置37 ℃培養箱內培養。

1.2.2CCK8實驗檢測細胞增殖 設置3個復孔，于藥物處理后培養24、48及72 h時，加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養4 h。使用酶標儀讀取波長490 nm處的吸光度(OD值)，取平均值，該OD值代表細胞的增殖能力。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞侵襲 藥物處理后各組U251細胞均使用胰酶消化，使用改良Eagle培養基(DMEM)培養液懸浮并調整細胞濃度為1×108個/L，Transwell小室上室加100 μL細胞懸液，將下室內加入DMEM培養液(含10%FBS)500 μL，設置3個平行復孔，37 ℃培養箱內放置24 h。取出小室，PBS洗滌2次，多聚甲醛(4%)固定30 min，1%結晶染色10 min，PBS洗滌并晾干，隨機選取3個視野在顯微鏡下觀察并統計細胞侵襲數，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移 藥物處理后的貼壁細胞以每孔1×106個細胞在6孔板內接種，置于37 ℃培養箱內，細胞貼壁單層生長時，使用無菌移液槍對6孔板表面垂直直線劃痕，PBS洗去脫落細胞，更換培養液培養48 h，每組均設置3個復孔，使用顯微鏡觀察劃痕距離并計算細胞遷移率，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.2.5流式細胞儀技術檢測細胞凋亡率 將藥物處理后5×105個對數生長期的U251細胞接種在75 mL的培養瓶內，加入10 mL F12培養液，干預24 h后，收集懸液及貼壁細胞，加入Annexin V-FITC488和PI溶液，室溫下避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測3次，取平均值。

1.2.6Western blot檢測β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達 取1.2.1中的細胞提取蛋白，加適量放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液冰上裂解細胞(30 min)，置于4 ℃環境中以12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。取等量總蛋白上樣，12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(dodecyl sulfate,sodium salt -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，直至電泳道膠的底端，轉膜，無蛋白快速封閉液封閉20 min，加一抗(1 ∶10 000)、二抗(1 ∶10 000)，以β-actin為內參，使用Image J軟件分析蛋白表達情況，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對細胞增殖的影響

結果顯示，藥物作用各時點，對照組的OD值高于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高藥物作用各時點的OD值均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜各組的OD值均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 靈芝三萜對U251細胞增殖的影響

2.2 對細胞侵襲的影響

結果顯示，藥物作用各時點，對照組的侵襲細胞數均多于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；靈芝三萜作用24、48及72 h時,隨著靈芝三萜濃度的升高侵襲細胞數均逐漸減少，但隨著作用時間的延長、不同濃度靈芝三萜轉染下的侵襲細胞數均增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 靈芝三萜對U251細胞侵襲的影響

2.3 對細胞遷移的影響

結果顯示，藥物作用各時點，對照組的細胞遷移率均高于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的細胞遷移率均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉染下的遷移率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 靈芝三萜對U251細胞遷移率的影響

2.4 對細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞各時點的凋亡率均高于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的細胞凋亡率均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉染下的凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 靈芝三萜對U251細胞凋亡的影響

2.5 β-catenin蛋白表達的變化

結果顯示，對照組藥物各作用時間的β-catenin蛋白表達均高于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的β-catenin蛋白表達均逐漸升高，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉染下的β-catenin蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表5。

表5 靈芝三萜對U251中β-catenin蛋白表達的影響

圖1 各組人膠質瘤細胞株U251中β-catenin蛋白表達(Western blot)

2.6 p-GSK-3β蛋白表達的變化

結果顯示，對照組藥物作用各時間點的p-GSK-3β蛋白表達均高于各靈芝三萜組，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的p-GSK-3β蛋白表達均逐漸升高，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉染下的p-GSK-3β蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表6。

表6 靈芝三萜對U251中p-GSK-3β蛋白表達的影響

圖2 各組人膠質瘤細胞株U251中p-GSK-3β蛋白表達(Western blot)

3 討論

臨床中已有較多研究證實Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發生和發展中均有重要作用，β-catenin在細胞核、細胞膜、細胞質內均存在，是Wnt信號通路中的關鍵信號樞紐[10]。正常狀態下機體內的Wnt信號通路未激活，細胞質內的β-catenin與GSK-3β相結合，隨之被相應受體磷酸化，并經泛素酶降解，因此正常狀態下胞質β-catenin水平始終較低。而當Wnt信號通路被異常激活時，β-catenin蛋白則因無法被降解而大量聚集在胞質內，并遷移至細胞核中，形成轉錄復合物，促使該通路下游靶基因轉錄，導致細胞生長[11-13]。因此當Wnt信號通路受到外界刺激異常激活時，β-catenin發生突變會造成細胞周期異常變化，細胞增殖失控，凋亡過程抑制，誘發腫瘤[14]。而腫瘤發生的實質則是癌細胞的持續分裂和增殖，因此通過調控Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，對于改善癌癥患者預后有重要意義[15]。

近年來中西醫結合治療膠質瘤取得了一定的進展，其中靈芝作為珍貴的中藥材也廣泛用于對癌癥患者的臨床治療中，作為抗腫瘤輔助藥物，靈芝不僅能夠增強機體的免疫力，對人體的毒副作用也較小[16-17]。但隨著各項研究的不斷深入，雖有研究已經明確靈芝對癌癥患者具有一定的治療作用，但尚未明確靈芝在癌癥治療中的具體作用機制，尚未清楚其是通過哪一個方面發揮的作用[18]。考慮到Wnt/β-catenin信號通路對癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等過程的影響[19]，本研究選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質瘤細胞株U251細胞，觀察不同劑量和不同作用時間U251細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的變化，分析靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質瘤細胞侵襲和遷移的影響，以期能為今后臨床治療提供指導。

靈芝三萜具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強免疫力等作用，是靈芝提取物的主要活性成分，已知其在細胞的增殖、鈣信號轉導和氧化應激等生物過程中均有重要作用[20-21]。本文結果顯示，使用靈芝三萜培養的人膠質瘤U251細胞株增殖、侵襲和遷移能力減弱，凋亡率升高，隨著靈芝三萜濃度的升高，這種作用愈發明顯，且該作用與Wnt/β-catenin信號通路相關。既往研究中發現含羥基的靈芝三萜物質靈芝酸A、H、F能夠對乳腺癌細胞的生長和侵襲產生抑制，這與本研究的結果相似。分析靈芝三萜的具體作用機制，發現靈芝三萜能夠對機體的免疫系統產生作用，進而影響中性粒細胞釋放炎癥介質，進而阻止了Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，對腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產生了影響[22]。同時靈芝三萜提高了機體的免疫活性，促進了T淋巴細胞活化，增強了化療藥物的作用效果，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力，達到了較佳的臨床效果[23]。

β-catenin蛋白是與細胞骨架相互作用的多功能蛋白，可促進細胞分裂基因的啟動；GSK-3β可調控糖原合成酶活性，介導信號蛋白結構蛋白和轉錄因子轉錄，可調節細胞的增殖、分化、存活和凋亡[24]。β-catenin、p-GSK-3β蛋白均為Wnt信號通路中的重要因子，本文中在靈芝三萜的作用下β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達明顯降低，說明靈芝三萜對Wnt信號通路產生了影響，進而對腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產生了影響。

綜上所述，靈芝三萜能夠通過Wnt信號通路抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。