DNA甲基轉移酶基因多態性與SLT治療腦卒中失語癥療效的關聯性*

張靜潔， 鄒郝晶， 徐酩， 邢影

(1.西安交通大學 外國語學院， 陜西 西安 710049； 2.江蘇省疾病預防控制中心， 江蘇 南京 210009； 3.西安大興醫院 內分泌科， 陜西 西安 710082)

腦卒中是導致成人殘疾甚至死亡的首要原因，而1/3腦卒中患者會出現失語癥的臨床癥狀，這是一種包括口語、寫作、聽覺理解和書面理解在內的語言交流障礙[1-3]，許多患者在被診斷為失語癥后，因溝通障礙而感到孤獨和痛苦[4]，使其社會參與度降低，嚴重影響生活質量，因此卒中后失語癥的恢復顯得極其重要。失語癥患者除了自發恢復外[5]，言語—語言治療(speech and language therapy,SLT)也可以促進患者語言溝通功能的恢復，其中治療強度、劑量以及持續時間是主要決定因素[3]。腦卒中后語言能力的恢復過程較為復雜，包括神經可塑性、腦功能重建和肌肉活動等，DNA甲基化作為一種特殊的基因表達調控機制均參與了上述過程[6-8]。有研究顯示，腦卒中后的血管生成與DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的活性呈正相關，Lin等[9]發現血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)基因的表達與血管生成呈負相關；而腦血管內皮細胞氧和葡萄糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)可以促進TSP-1基因啟動子甲基化來抑制TSP-1的表達，提示DNMTs的過表達和活性增強可以促進卒中后血管的生成[10]；Baccarelli等[11]也發現血液DNA甲基化與發生腦卒中的風險和低死亡率顯著相關；由此認為，DNMTs可能是卒中患者功能恢復的有利因素。在腦卒中的早期研究中，小鼠大腦中動脈栓(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型顯示卒中動物腦內的DNA甲基化呈整體上調狀態，且抑制DNMTs活性可以降低卒中的嚴重程度[12]；也有研究顯示，在腦卒中后整體恢復或運動技能學習的過程中，DNMTs多態性可減慢或減少卒中后失語癥患者的恢復[13]。本研究對DNMTs多態性在卒中后失語癥患者恢復過程中的潛在遺傳作用進行初步研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015年1月—2018年10月就診的腦卒中失語癥患者42例，其中男27例、女15例，平均(62.7±9.4)歲，69.0%患者有伴侶；在教育方面，所有患者均具有基本閱讀和理解能力，且59.5%研究對象接受過9年義務教育；在臨床類型方面，缺血性腦卒中30例(71.4%)，出血性腦卒中12例(28.6%)；腦卒中后的平均時間為(27.2±8.8)d，恢復治療的平均時間為(58.5±9.4)d。納入標準：(1)均被診斷為腦卒中后失語癥，并采用SLT法對其進行康復治療；(2)發病持續時間<3個月，且沒有自然痊愈的中國漢族人群；(3)所有受試者均被告知本次研究的整個項目，并簽署知情同意書；(4)研究獲醫學倫理委員會批準。排除標準：(1)無基本閱讀和理解能力；(2)酗酒、濫用藥物、疑似或病前癡呆和病前精神病的患者；(3)既往腦卒中引起的失語癥患者；(4)無法進行溝通患者；(5)卒中后抑郁癥患者。最終，共有42名腦卒中患者被納入本次研究。

1.2 方法

1.2.1STL治療前后處理 本研究采用前瞻性隨訪研究設計。所有研究對象在STL治療前均接受語言功能測試作為基線資料，以確保其為非自發性恢復；在STL治療后再次進行測試，以評估STL的治療效果；語言和交流方面存在問題的患者將按照標準SLT治療方案分配言語治療；失語癥由兩名來自不同醫院的物理康復治療專家獨立診斷。SLT是一套標準化的漢語標準失語癥檢查法，至少包括72項分級的篩查和失語癥嚴重程度量表(aphasia severity rating scale, ASRS)的專家評分。

1.2.2干預措施 住院腦卒中患者平均每周接受SLT治療4 h 。在SLT治療之前，評估每個患者的個人需求和語言能力，以制定個性化的治療方案。第1個月是認知語言治療，采取以認知障礙為導向的治療來優化處理受影響的語言層面(語義、語音、語法)；在語言功能初步好轉后，第2個月以恢復人際溝通能力為重點治療策略。以治療8周為1個研究周期，8周后對所有受試對象進行STL效果評估。

1.2.3結局評定和數據提取 采用Amsterdam-Nijmegen日常語言測試(ANELT)和Boston命名測試(BNT)對失語癥進行評分，并評估失語癥的恢復情況[14-15]，該方法是目前失語癥研究的較常見方法，具有客觀與可量化性。ANELT得分范圍為10～50分，BNT得分范圍為0～60分[16]，本研究以治療后ANELT得分-治療前ANELT得分=10分，或治療后BNT得分-治療前BNT得分=10分為SLT治療有效。按以上標準，本研究將接受治療后的42名腦卒中失語癥患者分為治療有效組(18例)及治療無效組(24例)。

1.2.4樣品制備和基因分型 采用QIAcube HT試劑盒(Qiagen，德國)按照說明書提取所有患者外周靜脈血中的全基因組DNA，用NanodropOneC超納米紫外分光光度計(ThermoFisher Scientific，美國) 測定A260/A280的比值來估計DNA的純度,下限和上限分別為1.8和2.0，純化后的DNA置-80 ℃保存待用。采用ABI7900HT實時PCR系統(Applied Biosystems, 美國)對DNMTs特定單核苷酸多態性(SNPs)進行基因分型，將特定的對照樣本(至少已知3個基因分型)加入每個樣品板進行質量控制。每位患者的SNP基因分型由兩位經驗豐富的實驗人員進行評估，隨機選擇超過10%的樣本進行驗證。

1.3 統計學分析

采用χ2擬合優度檢驗評估各個SNP基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(HWE)，采用Studentt檢驗對人口學和臨床特征等連續性變量在腦卒中失語癥治療有效患者組和治療無效患者組之間的分布差異進行比較。在調整年齡、性別、婚姻狀況、受教育程度等因素后，采用條件Logistic回歸分析計算各個SNP基因型的比值比(OR)和95%置信區間(95%CI)。采用SHEsis軟件對基因位點的多態性進行單體型分析。

2 結果

2.1 臨床特征

經過STL治療后，腦卒中失語癥治療有效和治療無效組患者的性別、年齡、配偶情況以及卒中類型比較，差異無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組腦卒中失語癥患者一般特征及臨床特征

2.2 DNMTs多態性與腦卒中失語癥的關聯分析

檢測42例腦卒中失語癥患者DNMTs基因(DNMT1、DNMT3A及DNMT3B)的基因型及等位基因分布，見表2。在8個DNMTs多態性中，僅有DNMT1rs222861的分布在腦卒中失語癥治療有效患者組和治療無效患者組的差異有統計學意義(P<0.05)；該SNP的C等位基因與腦卒中失語癥的治療無效風險呈正相關(OR=4.46，95%CI為1.27～15.60，P=0.019)；與攜帶TT基因型的患者相比，CC基因型和TC+CC基因型攜帶者腦卒中失語癥治療無效的風險增加(CC：OR=18.17，95%CI為1.38～238.91，P=0.027；TC+CC：OR=7.57，95%CI為1.25～45.92，P=0.019)。由于本研究樣本量較少，SNPrs2228612在分層分析中僅表現出對男性患者的治療無效性的重要影響(OR=35.17, 95%CI=1.68～735.28,P=0.022)，見表3。在此基礎上，對腦卒中失語癥患者的DNMTs多態性進行單體型分析，以評估同一基因中SNPs的聯合效應，結果顯示DNMT1的單倍型在腦卒中失語癥治療有效患者組和治療無效患者組中分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表2 8種DNMTs基因多態性在兩組腦卒中失語癥治療有效組與治療無效組患者中的分布[n(%)]

續表

表3 兩組腦卒中失語癥患者rs2228612 基因多態性分層分析[n(%)]

表4 兩組腦卒中失語癥患者DNMT1 基因SNP位點的單倍型分析[n(%)]

3 討論

研究表明，一些神經營養因子和腦功能相關基因是卒中后失語癥恢復治療的潛在靶點或影響因素，其中，BDNF、GRIN2A和CNKSR2等“關鍵基因”與失語癥恢復治療有著很強的相關性[16-21]。盡管在不同疾病中的作用和影響還存在一定的爭議，但在某些特定疾病中，這些基因的甲基化和特殊的多態性可以增加疾病發生的風險，也是疾病恢復過程中的重要阻礙因素。

本研究通過分析DNMT1、DNMT3A和DNMT3B多態性對卒中后失語癥患者語言恢復的影響，結果發現DNMT1多態性rs2228612與卒中后失語癥患者恢復的不良結局顯著相關，表明rs2228612是卒中后失語癥恢復的危險因素，降低了失語癥治療的成功率。有研究發現，特定BDNF多態性中Met等位基因對中國、美國缺血性腦卒中患者的結局影響不同[16,22]。但本研究在千人基因組計劃基礎上進一步分析發現，并沒有實質性的證據表明只有Met等位基因在這兩組人群之間存在差異。而且不同種族之間的DNA甲基化模式存在較大差異已被廣泛證實。因此，甲基化在不同人群之間的差異似乎比特定的多態性更可信，尤其是在卒中后失語癥中。

本研究存在一些局限性。當前研究的樣本量較小，雖然已經滿足最小樣本含量，但失語癥恢復評估測試的最終分值差異較大，減少了發現DNMTs基因存在顯著差異的機會，甚至可能會影響住院患者康復的進度。另一方面，甲基化修飾形式太多，如CpG島甲基化、DNA相關轉錄因子甲基化以及mRNA甲基化(m6A或m5)等。這些甲基化修飾是疾病發生、發展和康復的過程中普遍存在的甲基化調控機制，相當復雜。此外，在臨床實踐中，失用癥通常會伴隨失語癥，在失語癥住院患者中很難通過語言表現障礙來鑒別失用癥。在接下來的臨床調查和基礎研究中，將重點研究高甲基化的機制并補充相應信息。

綜上所述，DNMT1rs2228612的不同遺傳模式可以影響中國人群腦卒中后失語癥的康復效果。如果可以在大樣本人群中得到證實，則該SNP可能是SLT治療卒中后失語癥的重要補充指標。