不同莓果提取物對小鼠慢性酒精性肝病的作用*

肖婷， 郭正紅， 駱光佳， 張道芳， 陶玲， 沈祥春**

(1.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 藥學院， 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心， 天然藥物資源優效利用重點實驗室， 貴州 貴陽 550025; 3.貴州中醫藥大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)又稱為酒精性肝損傷，是由酗酒引起的肝臟疾病，其中超過40%ALD患者死于酒精性肝硬化[1]。雖然ALD發病率呈逐年遞增的趨勢，但發病機制比較復雜，其針對性治療用藥也并不明確。研究顯示氧化應激和炎癥反應是其發生發展的關鍵環節[2]，清除自由基和抗氧化是防治和治療ALD的主要途徑。乙醇在肝臟中主要通過乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶以及細胞色素P450進行代謝，在此過程中會產生過多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起體內的抗氧化系統紊亂，造成脂肝細胞損傷和死亡[3]。因此，含有抗氧化活性成分的植物資源成為開發臨床治療ALD潛在藥物的關注重點。莓果類植物資源抗氧化活性最高，包括藍莓、枸杞及桑葚等。枸杞總黃酮能明顯降低丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)，有效改善肝臟的脂質過氧化，對肝臟具有較好的保護作用[4-5]。桑葚無糖提取物具有很強的抗氧化能力，我國歷代的中醫本草公認桑葚有補肝益腎、降壓消渴和解酒的功效，可用于治療肝腎陽虛[6-7]。當前，藍莓、枸杞及桑葚這3種植物資源受到廣泛關注，但是將其ALD保護作用進行對比研究卻很少。本研究通過建立慢性小鼠ALD模型，觀察藍莓、枸杞及桑葚提取物對ALD小鼠肝臟的保護作用，并進行相互間效果差異對比。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 雄性昆明種小鼠110只，體質量18～20 g，購自貴州醫科大學實驗動物中心[合格證號 SCXK(遼)2015-0001]。

1.1.2莓果與主要試劑 藍莓(黑龍江九三局山河農場藍莓公司)，桑葚(貴州安龍大秦農業公園)，枸杞(寧夏杞天下生物科技有限公司)；無水乙醇(上海沃凱生物試劑有限公司)，甲醛(天津市永大化學試劑有限公司)。

1.1.3主要儀器 BS110S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，FD-1D-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)，KH-300B型超聲波清洗器(昆山禾創超聲波儀器有限公司)，SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵和旋轉蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司)，TBA-40FR自動生化分析儀(日本東芝醫療系統株式會社)，XDS-2B倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模及分組 參照文獻[8]的造模及實驗方法。110只小鼠隨機均分為空白組、模型組、藍莓提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組、枸杞提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組、桑葚提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組。適應性飼養 1 周后，用于慢性酒精性肝損傷實驗。實驗周期為 1 個月，此期間，空白組小鼠不做任何干預，自由給予水，與其他組喂養相同的飼料；模型組小鼠前15 d不做干預，后15 d每日定時灌胃30%乙醇(10 mL/kg) 進行造模；藍莓、枸杞、桑葚提取物(低、中、高劑量)組小鼠每日定時灌胃相應劑量的莓果提取物 (5‰ CMC-Na 混懸)，實驗前15 d每日定時灌胃不同劑量的莓果提取物，4 h 后灌胃給予30%乙醇進行慢性肝損傷模型制備。

1.2.2體質量和肝臟指數測定 實驗結束時各組小鼠禁食 4 h，稱量體質量，經腹腔注射60 mg/kg 戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，摘眼球取血；取各組小鼠肝臟組織，生理鹽水洗凈，吸干多余水分后進行稱重并計算肝臟指數。

1.2.3血清生化指標檢測 取“1.2.2”項下各組小鼠血清適量，靜置1 h，1 500 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃低溫保存，于自動生化分析儀中檢測各組小鼠血清膽固醇(cholesterol，CHOL)、血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST) 含量。

1.2.4蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE ) 取“1.2.2”項下各組小鼠肝左葉組織于10%甲醛中保存48 h，用于肝臟組織病理學檢查；38%鹽酸1 mL和75%乙醇99 mL配置成1%鹽酸乙醇分化液，28% 氨水0.2 mL和蒸餾水100 mL 配置成0.2%氨水，pH調至7.5；60 ℃ 下烤片2 h，二甲苯中脫蠟5～10 min，移入二甲苯和純酒精(1 ∶1)混合液中5 min，依次加入100%、95%、85%、70%酒精浸泡，2～5 min/次；蒸餾水清洗，蘇木精染液染色5～15 min，1%鹽酸乙醇分化液分色；鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止；0.2%氨水中堿化或藍化，即細胞核呈藍色；蒸餾水短洗 1 min，0.3%伊紅染液染色5 min；蒸餾水短洗1 min，37 ℃烘干0.5 h，中性樹膠封固；觀察各組小鼠肝臟組織形態學改變情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般狀態

實驗前，各組小鼠狀態均良好，體型適中，毛色有光澤，活動靈敏，胃口較好，睡眠良好，情緒較為穩定，無相互撕咬現象；實驗結束時，空白組小鼠一般狀態與實驗前差異不大，而模型組小鼠狀態差、毛色暗黃無光且蓬松、出現嚴重掉毛和相互撕咬現象、胃口較差、體型消瘦，桑葚提取物組小鼠狀態一般、皮毛顏色偏黃略有蓬松、體型稍顯瘦弱、動作靈敏、情緒尚且穩定，藍莓提取物組和枸杞提取物組小鼠狀態略差、皮毛松軟、顏色微黃同時出現少量皮毛脫落現象、情緒較暴躁、出現相互撕咬現象、反應略遲鈍。

2.2 體質量和肝臟指數

與空白組相比，模型組小鼠體質量明顯減輕、肝臟指數明顯升高 (P<0.001)；與模型組相比，桑葚提取物低、中、高劑量組小鼠體質量升高、肝臟指數下降 (P<0.05)，而枸杞和藍莓提取物低、中、高劑量組間小鼠體質量及肝臟指數比較、差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體質量和肝臟指數

2.3 血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

與空白組相比，模型組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL 含量明顯升高 (P<0.001)；與模型組相比，枸杞和桑葚提取物低、中及高劑量組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；與模型組相比，藍莓提取物低、中及高劑量組小鼠血清AST、LDL、TBIL及CHOL含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，3組提取物低、中及高劑量小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

2.4 HE染色

空白組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態大小規整，輪廓清晰，細胞間緊密接觸，以中央靜脈為中心大致呈放射狀排列；模型組小鼠肝細胞出現廣泛的空泡變性、氣球樣變，肝細胞水腫，胞漿成顆粒狀；桑葚提取物低劑量組小鼠肝細胞廣泛的水腫、并伴有炎癥，中劑量組小鼠胞質形成空泡化、匯管區域周圍的肝細胞胞質變性、并且細胞間嗜酸性顆粒密度增加，高劑量組較模型組的空泡變性顯著減少、且肝細胞大小形態無明顯異常、著色清晰、組織細胞排列均勻、較其他提取物劑量組更接近空白組肝細胞形態；枸杞提取物低劑量組小鼠肝細胞出現廣泛的水腫及空泡變性、伴有細胞核破裂，中劑量組小鼠肝細胞部分組織邊緣有壞死、且觀察到部分肝細胞有明顯的嗜酸性變，高劑量組小鼠肝細胞有輕度水腫、可見少許空泡變性、中央靜脈周圍肝細胞水樣變性；藍莓提取物低劑量組小鼠肝細胞存在廣泛的水腫、空泡變性及氣球樣變，中劑量組小鼠肝細胞依然存在大量的空泡變性及嗜酸性變，高劑量組組小鼠肝細胞出現少量空泡變性和水樣變性、肝細胞水腫；由此可見3種莓果提取物均可改善小鼠肝臟病變程度，但作用強弱有別，桑葚提取物表現出了最好的改善作用，其次為枸杞和藍莓。見圖1。

注：A為空白組，B為模型組，C～E分別為桑葚提取物低、中、高劑量組，F～H分別為枸杞提取物低、中、高劑量組，I～K分別為藍莓提取物低、中、高劑量組。

3 討論

ALD是由于長期大量飲酒，從而使得酒精與肝臟細胞頻繁接觸而導致肝臟損傷[2]。ALD可使肝臟細胞脂質過氧化，造成肝臟細胞壞死、凋亡、炎癥、纖維化等病理變化，最終導致肝硬化甚至肝癌等疾病[9]。在我國，ALD占同期住院肝病患者構成比呈逐年上升趨勢[10]。研究證明，長期過量飲酒導致小鼠食欲和吸收功能降低[11]，易造成小鼠營養不良、體質量下降[12]；肝損害會引起小鼠肝腫大、發育不良和肝硬化，肝臟指數在一定程度上可以反映肝臟的損傷[13]，當肝臟指數增加時，很可能是肝臟發生了腫大，發生增生、充血及水腫等病變[14]。本研究中模型組小鼠體質量較空白組下降、肝臟指數升高，說明造模成功；而采用莓果提取物進行預保護的給藥組，體質量和肝指數均較模型組有所改善，在一定程度上對慢性ALD具有保護作用。

細胞酶是人體代謝過程中必不可少的催化劑[15]。ALD中存在脂代謝紊亂和轉氨酶活性改變，由于酒精濫用會損害細胞膜的滲透性，導致儲存在肝臟中的細胞酶會滲漏到血漿中[16]。血清ALT、AST、TBIL、CHOL及LDL是ALD的敏感觀察指標，其中血清ALT和AST是肝臟功能重要的診斷指標[15，17-18]。ALT主要分布在肝細胞漿，AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞的線粒體中，在正常情況下，2種酶只有極少量釋放入血液中，故血清中2種酶的活性很低，但當肝組織受到急性損傷或細胞膜通透性增加時，ALT和AST大量釋放到血液中，血清中酶的活性明顯增高，因此血清ALT和AST升高幅度能反映肝細胞受損程度[19-21]。血清CHOL和LDL是診斷肝臟脂質代謝的重要指標，且游離CHOL是炎癥的潛在誘因和肝纖維化的驅動因素[18]。脂質代謝異常作為ALD的一種并發癥狀，表現為酒精及代謝產物會導致血液中LDL含量增加，同時引起CHOL含量升高[18，21]。作為肝臟功能的重要診斷工具，血清TBIL水平與代謝綜合征有密切的關系，如動脈粥樣硬化和肝臟疾病[22]。TBIL主要由衰老的紅細胞在肝、脾和骨髓等網狀內皮系統內破壞降解而來，當肝細胞功能受到損傷或結構被破壞，或者膽汁排泄通路的障礙，其攝取、轉化和排泄膽紅素的能力降低，可導致膽汁攝取、轉化、分泌及運輸障礙，使肝臟清除膽紅素的能力下降，使TBIL值增高[23]。因此以血清ALT、AST、LDL、CHOL及TBIL為指標，對小鼠肝損傷程度進行檢測具有參考意義。本研究結果顯示，3種莓果提取物均能夠不同程度地降低小鼠各血清指標，保護慢性酒精性肝損傷。

酒精在肝臟中通過乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系統進行氧化代謝，主要中間代謝產物為乙醛，乙醛進一步在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸[24]。ALD主要是乙醇及其衍生物乙醛的代謝過程中直接或間接誘導的炎癥反應、氧化應激、腸源性內毒素、炎性介質及營養失衡等多種因素相互作用的結果，導致肉眼可見肝臟體積明顯腫大、色黃、膩感及質地脆[24-25]；光鏡下可見肝細胞體積腫脹、氣球樣變及點狀壞死，變性的肝細胞內可見嗜酸性包涵體、周圍常見中性粒細胞浸潤[26-27]。本研究結果表明，模型組小鼠肝組織出現了空泡變性、水腫及肝細胞排列混亂等損傷，而3種莓果提取物對肝組織的水腫、變性等損傷有一定的改善作用，尤其是桑葚提取物高劑量組，其改善后肝組織和空白組相差不大。莓果提取物可通過抗氧化、促進凋亡等方式保護小鼠慢性ALD[8]。3種莓果提取物均可改善乙醇造成的小鼠肝臟損傷，但改善作用強弱有所差異，可能與它們含有的酚酸、黃酮以及花色苷等成分差異有關，具體的干預機制還有待進一步研究。

綜上所述，通過對小鼠體質量、肝臟指數和血清ALT、AST、TBIL、CHOL、LDL水平及肝臟病理組織切片觀察進行分析可知，藍莓、枸杞及桑葚3種莓果提取物均對小鼠慢性ALD有一定的改善作用，但改善作用強弱有一定差異，桑葚提取物表現出了最強的活性，其次為枸杞和藍莓提取物。本研究結果將有助于進一步闡述莓果類提取物對ALD的輔助保護作用，為莓果類食源性天然產物開發成為輔助保護肝損傷功能食品提供一定的實驗基礎。