多黏菌素B對大鼠全腦缺血再灌注時脂多糖所致損傷的保護作用及機制*

鄭思敏， 李思遠， 牛曉麗， 楊毅猛， 薛榮亮

(西安交通大學第二附屬醫院 麻醉科， 陜西 西安 710041)

研究表明，腦缺血再灌注損傷的機制由多因素共同參與并相互作用。低血壓、休克、心臟驟停可致全身多器官缺血，其中腸道是敏感器官。腸道缺血引起腸黏膜屏障受損，大量釋放細菌內毒素入血，啟動多損傷環節，對腸外器官造成損傷[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)存在于革蘭陰性菌的細胞膜上，是一種內毒素，在對動物發病機理的研究中，LPS作為主要的炎癥因子，可引起機體發熱、血壓下降、激活炎癥反應等[2]。研究發現，LPS多聚體與宿主的LPS結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結合后，激活外周血單核細胞表面的LPS受體，即白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)，通過LPS/ Toll樣受體4 (toll like receptor 4,TLR4)信號通路激活相關的基因轉錄，誘導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等早期促炎因子的生成，如血小板激活因子、白三烯等促炎因子，進而加重各器官的損傷[3]。多黏菌素是從多黏桿菌中分離的一類抗生素，用于臨床的有多黏菌素B(polymycin B，PMB)和多黏菌素E(polymycin E，PME)，PMB通過其具有疏水性的陽離子結構與類脂A特異性結合，抑制LPS的生物活性[4]。關于PMB在腦缺血再灌注損傷的中的作用機制目前尚未完全清楚，因此，本研究通過建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，并尾靜脈注射用PMB及LPS，分析大鼠的神經行為學評分、海馬組織的細胞凋亡率、LPS含量及TLR4表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 健康清潔的成年雄性SD大鼠144只，體質量200～250 g，由西安交通大學醫學院動物中實驗心提供，按照隨機數字表法分為對照組(SH組)、模型組(IR組)、脂多糖組(LPS組)和多黏菌素B組(PMB+LPS組)，每組36只。后3組大鼠采用經典四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5]，LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS(500 μg/kg)[6]，PMB+LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS、注射完畢后立即更換注射器尾靜脈注射PMB(0.5 mg/kg)[7]，SH組及IR組再灌注后即刻注射等量生理鹽水。每組根據再灌注時間的不同再分為2、6、12、24、48及72 h 六個亞組，每亞組6只。各組大鼠按要求在預定時間點麻醉后處死。

1.1.2試劑和儀器 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析試劑盒購自美國R&D Systems公司，LPS購自美國sigma公司PMB購自美國INALCO公司，Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；液氮罐由中國成都生產，超凈工作臺購自美國Airtech公司，低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司，包埋機購自德國leica公司，烤片機購自德國leica公司，石蠟切片機購自德國leica公司，倒置顯微鏡購自德國leica公司，計算機圖像分析系統購自德國leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備 采用四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5]。10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射對大鼠進行麻醉，大鼠翻正反射及痛覺消失視為麻醉滿意；麻醉滿意后采用俯臥位固定四肢，頭前傾約30°，同時用橡皮筋栓住大鼠尾巴以輕微力量牽拉，使頸椎伸直，此時翼小孔呈水平位便于觀察；取枕骨下第一頸椎水平做正中切口，逐層分離肌肉，仔細分離雙側第一頸椎橫突，暴露翼小孔，雙側翼小孔下各有椎動脈通過，用燒紅的探針刺入翼小孔燒灼椎動脈，使之永久閉塞，避免損傷脊髓及枕后三角區神經，逐層縫合皮下及皮膚。術后單籠飼養，保持室溫20～25 ℃，并用60 W白熾燈持續照射24 h，防止體溫下降；同時保持大鼠呼吸道通暢，密切觀察其復蘇過程。術后第2天，同法麻醉后仰臥位固定，取頸正中切口，仔細分離雙側頸總動脈(注意勿傷及與之伴行的迷走神經)、分別微動脈夾夾閉6 min、松開微動脈夾恢復腦血流、逐層嚴密縫合。術后單籠飼養，條件如前。SH組僅進行組織解剖及縫合，不給予凝斷椎動脈及夾閉雙側頸總動脈處理。

1.2.2神經行為學評分[9]大鼠處死前30 min由一名不清楚實驗分組的研究人員對所有大鼠進行神經行為學評分，分為步態協調、平衡木實驗及斜扳試驗。(1)步態協調：缺失(表現為靜止或原地轉圈)記1分，不正常(表現為步態搖晃且速度減慢)記2分，正常記3分。(2)平衡木實驗：大鼠放置于長1 m、寬2 cm、離地面0.5 m的圓形平衡木上，記錄大鼠的表現；立即脫落記1分，試圖停留記2分，可正常停留記3分。(3)斜扳試驗：將大鼠頭向下倒置在45°斜面上，觀察大鼠是否能轉為頭向上>135°及爬行情況，迅速轉為頭向上>135°、且可順利向上爬記1分，抓握斜面>5 s后轉為頭向上>135°、爬行困難記2分，順斜面下滑記3分。

1.2.3LPS含量 各組大鼠按要求在預定時間點麻醉后處死、斷頭，撬開顱骨，完整取出大腦組織置于盛有4 ℃ PBS溶液的培養皿中，剝離腦膜和腦皮質分離出雙側海馬組織，立即置入液氮罐凍存，后轉移至-80 ℃冰箱保存，1個月內進行ELISA檢測LPS含量。

1.2.4細胞凋亡率檢測[8]按照1.2.3的方法分離出大鼠雙側海馬組織，再用PBS溶液洗去海馬組織上殘留血液后放入裝有4 ℃ PBS溶液的離心管中，置入冰盒保存，在30 min內進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5海馬CA1區TLR4陽性表達 將不同時間點處死的各組大鼠沿枕骨撬開顱骨，仔細剝離蛛網膜及軟膜，取出完整大腦，在視交叉后1 mm及視交叉后4 mm處各切一刀(即海馬頭端)取冠狀面組織塊；于4%多聚甲醛液中浸泡，4 ℃保存3 d，常規石蠟包埋，并采用切片機連續腦冠狀面切片制備蠟塊。按照試劑盒說明書進行HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠各時點缺血再灌注的右側海馬組織病理學變化，胞質呈現棕黃色即表示陽性細胞，隨機選擇海馬CA1區5個視野(× 400)進行陽性細胞計數。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 神經行為學評分

結果顯示，隨著時間的延長，與LPS組相比，IR組和LPS+PMB組大鼠的神經行為學評分增加(P<0.05)，但上述3組各時點評分均低于SH組(P<0.05)。見表1。

表1 再灌注后不同時點4組大鼠神經行為學評分

2.2 海馬組織LPS含量

結果顯示，4組大鼠各時點LPS含量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中SH組各時點海馬區LPS含量最低，LPS組最高(P<0.05)。隨著時間的延長，IR組和LPS組大鼠海馬組織LPS含量均于再灌注2 h時開始增多，24 h達高峰，隨后緩慢下降，且各時間點均明顯高于SH組(P<0.01)；LPS+PMB組大鼠海馬組織各時間點LPS含量較LPS組均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 再灌注后不同時點4組大鼠海馬組織LPS含量

2.3 海馬細胞凋亡率

結果顯示，SH組海馬細胞各時點細胞凋亡率變化不明顯(P>0.05)，其他3組于再灌注后2 h海馬細胞的凋亡率開始升高、24 h達峰值、72 h開始下降；各時點海馬細胞凋亡率比較LPS組>IR組>LPS+PMB組>SH組(P<0.05)。見表3。

表3 再灌注后不同時點4組大鼠海馬細胞凋亡率

2.4 海馬CA1區椎體細胞損傷

HE染色結果顯示，與SH組比較，IR組各亞組大鼠海馬CA1區椎體細胞受損嚴重；LPS組2 h亞組大鼠海馬可見少量異常椎體細胞，胞漿強嗜酸性變、核固縮、無核仁消失，隨再灌注時間延長，椎體細胞排列紊亂、異常細胞數目增多、體積縮小，胞漿、胞核固縮明顯，可見核仁消失，核碎裂，溶解；以24 h亞組受損最為嚴重。LPS+PMB組大鼠海馬組織學改變介于LPS組與IR組之間。再灌注24 h各組海馬CA1區細胞形態見圖1。

注：箭頭所指為陽性細胞。

2.5 海馬CA1區TLR4陽性細胞指數

結果顯示，SH組及IR組大鼠海馬CA1區各時點TLR4表達較少，LPS組大鼠海馬CA1區大鼠海馬CA1區TLR4的表達于再灌注2 h時即出現升高、24 h達高峰、72 h表達下降(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+PMB組及IR組大鼠海馬CA1區各時點的TLR4表達均下降(P<0.05)。見表4、圖2。

注：箭頭所指為陽性細胞。

表4 再灌注后不同時點4組大鼠海馬CA1區TLR4陽性細胞指數

3 討論

當機體處于低血壓、休克、心臟驟停及腦卒中等狀態中時可出現腦缺血再灌注[10]，因為腦組織的能量幾乎完全依靠葡萄糖的有氧氧化提供，其能量儲備十分有限，故對缺氧耐受性極差[11]。因此，缺血再灌注會引起一系列的病理生理改變，使大腦出現嚴重的機能障礙。有研究發現，常溫狀態下，完全缺血10 s，腦組織儲備氧即可耗盡，葡萄糖有氧代謝終止，2～4 min腦組織儲存的葡萄糖及糖原耗竭，完全缺血4 min后，腦組織內能量幾乎為零，最終導致大腦功能和形態結構的改變[12]。因此，對于腦缺血再灌注的病理生理及保護機制的研究至關重要。

細胞凋亡(apoptosis)是機體細胞在正常生理或病理狀態下發生的一種自發的程序化死亡過程，具有主動性、選擇性、可逆性的特點。它的發生受到機體的嚴密調控。凋亡并不完全等同于程序性的細胞死亡(programmed cell death，PCD)，凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要病理生理機制之一[13]。腸道是失血性休克缺血再灌注損傷受累最早的器官之一，是應激反應的中心，且腸道對休克的反應最敏感。在休克有效循環血量減少時，機體為維持心、腦等重要臟器的血液供應，全身血液重新分配，胃腸道血流明顯減少。低血容量尚未產生全身癥狀或生命體征變化時小腸和結腸的血流已減少50%，故腸道缺血發生在早期[14-16]。即使經過復蘇，在血流動力學恢復正常后，腸道血流量仍低于正常水平。腸內細菌經腸黏膜至局部淋巴結或血液的這一現象稱為細菌移位，細菌移位可引發菌血癥或膿毒血癥，感染組織器官。腸道細菌和內毒素吸收入血，作用于靶器官，釋放大量炎性介質、氧自由基，前列腺素及多種細胞因子，損傷內皮細胞，產生細胞毒效應和全身代謝紊亂，最終導致遠端器官的損害[17-19]。已經有研究報道LPS對肺臟、肝臟、腎臟等組織缺血再灌注時的損傷作用[20]，但對腦組織的研究未見報道。

本研究結果表明，除對照組外，其他各組再灌注后2 h海馬神經元開始發生凋亡，且凋亡率隨時間延長不斷升高，于24 h達峰值，72 h開始下降。且LPS組各時點的凋亡率均高于其他3組，提示LPS可增加全腦缺血再灌注導致的海馬神經元凋亡。但對LPS組小鼠尾靜脈注射PMB后，各時間點大鼠海馬區LPS含量均較LPS組減少，神經元凋亡率下降，提示PMB可能對損傷起到一定的抑制作用[21-22]。

進一步對各組大鼠進行神經行為學評分，結果提示PMB+LPS組的評分高于LPS組，再次提示在大鼠全腦缺血再灌注時，PMB對內毒素所致的神經元損傷有保護作用。SH組各時點血清TLR4表達很少，而其他3組于再灌注2 h即出現升高，24 h達高峰，之后開始減少，但仍處于較高水平，且均高于SH組。研究還發現LPS組各時點均較IR組表達增加，而LPS+PMB組各時點均較IR組表達減少，提示PMB對大鼠全腦缺血再灌注時造成的損傷可以起到一定的保護作用，且這種保護作用可能是通過抑制了TLR4的表達而實現的[23-25]。

綜上所述，全腦缺血再灌注時腦組織內LPS含量隨時間不斷變化并造成大腦損傷，PMB對該種損傷有保護作用，可能是通過抑制TLR4的表達進而阻止損傷。