過表達LHPP對人膽管癌細胞增殖的作用及機制*

宋春灼， 李想， 李俊俊， 劉猛， 付立躍， 朱海濤1，***

(1.貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 臨床醫學院， 貴州 貴陽 550004)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是膽管上皮來源的惡性腫瘤，在原發性肝臟惡性腫瘤中排第二位[1]。根治性手術切除是目前CCA患者可能獲得長期生存的最佳治療手段[2]。但由于CCA患者早期無特異性臨床癥狀，大多數患者在明確診斷時已喪失手術機會[3]，因此，明確CCA在發生發展過程中的分子機制將對該病的早期診斷及臨床治療大有裨益。磷脂磷酸組氨酸無機焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP)是在牛肝組織中發現的一種磷酸酶[4]，有研究表明LHPP在肝癌、膀胱癌、宮頸癌和胰腺癌等多種實體惡性腫瘤中發揮抑癌作用[5-8]，而LHPP在CCA中的作用卻少見報道。因此，本研究通過在CCA細胞中過表達LHPP基因，觀察其對CCA細胞增殖能力的影響并探究其可能機制，為CCA的臨床治療策略提供理論基礎。

實踐中，許多自由貿易協定內包含有規定自貿園區貨物在自由貿易協定下如何對待的特殊條款。通常，自由貿易協定限制或禁止來源于成員國自貿園區安排下的貨物享有自由貿易協定的內部優惠關稅，換言之，自由貿易協定中的自貿園區特殊條款將自貿園區貨物視為區域外產品，并應服從區域統一外部關稅安排。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人正常肝內膽管上皮細胞株HIBEpiC購于中國科學院細胞庫，CCA細胞株TFK-1、HuCCT-1由華中科技大學附屬同濟醫院膽胰實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640培養基、含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶溶液(美國Gibco)，胎牛血清(以色列BI)，1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液(美國Corning)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(上海Dojido)，聚凝胺(polybrene)、5×蛋白上樣緩沖液(5×loading buffer)及嘌呤霉素(北京Solarbio)，RIPA裂解液、4%多聚甲醛及0.01%結晶紫(廣州Affinity)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ,GAPDH)、鼠抗人蛋白激酶B(protein kinase B ,AKT)、兔抗人抑癌基因(human tumor suppressor gene，P53)及兔抗人LHPP單克隆抗體(武漢Proteintech Group)，兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B ,p-AKT)單克隆抗體(美國CST)，羊抗兔/鼠二抗(武漢Boster)，慢病毒包裝由上海吉滿生物公司完成；371型恒溫細胞培養箱和多功能酶標儀(美國Thermo)，普通離心機(德國Heraeus)，普通倒置顯微鏡(日本Nikon)，電泳儀和搖床儀(北京六一生物)。

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1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及慢病毒感染 所有細胞株均培養在RPMI-1640培養基中，培養基中添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液，細胞放在培養箱中(37 ℃、5%CO2)培養。在TFK-1和HuCCT-1細胞中分別用過表達LHPP慢病毒載體及其空白對照慢病毒載體進行感染，將細胞分為過表達LHPP組(LHPP組)和對照組(NC組)。10 mmol/L polybrene感染48 h，用2 mmol/L嘌呤霉素篩選穩定表達細胞株。

1.2.2細胞增殖實驗 采用CCK-8法，分別收集2種CCA細胞的LHPP組和NC組細胞，胰酶消化并計數，按3×103個/孔細胞接種在96孔板中，每組設置5個復孔，細胞接種6 h測定為0 h的細胞活力，然后分別于24、48及72 h測定細胞活力；測定時吸出原培養基，向每孔中加預先配置的含CCK-8溶液110 μL(無血清RPMI-1640培養基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10)，置于培養箱孵育2 h，于酶標儀450 nm處測量吸光度(optical density，OD)值并繪制生長曲線。

CCK-8實驗結果顯示， LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞于48 和72 h時OD值均較NC組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

Western blot檢測結果表明， LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞中LHPP蛋白表達量均較NC組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

1.3 統計學分析

1.2.4Western blot分析 收集狀態良好的各組待測細胞，RIPA裂解液于冰上裂解 30 min；超聲破碎10 s，12 000 r/min于 4℃離心10 min，收集上清蛋白液；加適量5×loading buffer于蛋白樣品中，100 ℃變性10 min；取蛋白50 μg上樣，10%丙烯酰胺凝膠經100 V恒壓電泳2 h，250 mA恒流電轉90 min，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)溶液在常溫下封閉2 h；按目的蛋白分子量裁剪PVDF膜，并將PVDF膜置于稀釋度為 1 ∶1 000 的一抗(兔抗人GAPDH、鼠抗人AKT、兔抗人p-AKT、兔抗人P53及兔抗人LHPP單克隆抗體)中，4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST) 洗滌3次，再與相應二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，滴加超敏曝光液檢測蛋白質。

2 結果

2.1 LHPP的表達

這位來自波恩的維也納藝術家，“所有藝術都屬于他，屬于他那徹底直接的藝術作品。他是個有血有肉的人，從各方面來看都是個偉人。……他曾活在世上，如今死去，卻將永生?！?/p>

注：A為細胞株LHPP蛋白圖，B為LHPP相對表達量；(1)與HIBEpiC細胞比較，P<0.05。

2.2 CCA細胞中過表達LHPP

1.2.3細胞克隆 取對數生長期的各組細胞，計數調整細胞濃度，在6孔板中種植1×103個/孔細胞；待14 d后吸去皿里的培養基，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，拍照記錄并計算各組的克隆數。

Western blot檢測結果表明，與人正常肝內膽管上皮細胞HIBEpiC相比，人CCA細胞株TFK-1、HuCCT-1細胞中LHPP蛋白表達量均下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為Western blot結果，B為LHPP相對表達量；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.3 CCK-8實驗

在孫中山先生眼中，西南鐵路系統建設意義重大。是“西南各省全部之繁榮為最有用者也”，“種種豐富之礦產可以開發，而城鎮亦可于沿途建之”。但孫中山先生也看到，西南鐵路建設難度極大?！拔髂系胤剑亟噪U峻?！薄按酥T地者，非山即谷?！薄肮式ù酥T鐵路之工程上困難，比之西北平原鐵路系統，乃至數倍。多數之隧道與鑿山路，須行開鑿，故建筑之費，此諸路當為中國各路之冠。”

注：A為TFK-1細胞，B為HuCCT-1細胞；(1)與同時點NC組比較，P<0.05。

2.4 細胞克隆

Western blot結果顯示，與NC組相比，LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞中總AKT蛋白表達無明顯改變，但p-AKT蛋白表達相對下降、P53蛋白表達則增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為細胞克隆形成，B為細胞克隆數定量表達；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.5 AKT、p-AKT及P53蛋白的表達

克隆形成實驗結果顯示，LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞的克隆形成能力均較NC組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot結果，B、C及D分別為AKT、p-AKT及P53相對表達量；(1)與NC組比較，P<0.05。

3 討論

CCA具有發病隱匿、早期診斷困難、惡性程度高及預后不良等特點，是腹腔難治性惡性腫瘤之一[9-10]。在我國，CCA患者手術切除后1、3及5年生存率僅分別為71.7%、38.2%及10.9%[11]。這意味著，探索CCA發生的新的分子機制將對CCA的臨床診斷及治療尤為重要。

在對話教學過程中，要改變傳統的教學方式。如問答式對話教學——以教師為中心和啟發式對話教學——以學生為中心，轉變為交互式對話教學——以雙主體為中心，使教師和學生之間成為一種平等的對話關系，對于知識的把握只存在時間上的差別。

LHPP基因是鹵醇脫鹵酶HAD(haloacid dehalogenas)超家族的成員之一，位于人類10號染色體(10q26.13)上，由7個外顯子編碼構成3個亮氨酸拉鏈樣結構域，能剪接產生9個轉錄變體[12]。LHPP可以有效水解焦磷酸中的氧-磷鍵、以及亞氨基二磷酸、3-磷酸組氨酸和6-磷酸賴氨酸中的氮-磷鍵，在參與調控信號轉導及細胞生長、分化等過程中發揮重要作用[4,13-15]。最近，許多獨立的全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)將LHPP確定為癌癥相關風險基因，如LHPP變異體(LHPP rs201982221)是口腔癌和咽癌的新風險基因[16]，LHPP變異體(LHPP rs35837782)被認為是B細胞前體急性淋巴細胞白血病(B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL)的常見風險基因[17]，內含子LHPP單核苷酸多態性(rs61408740)被鑒定為睪丸生殖細胞腫瘤易感性相關的8個新風險基因之一[18]。另外，同樣有研究表明LHPP參與調控腫瘤發生發展的過程，Hindupur 等[19]研究證明了LHPP在肝癌組織中低表達，且低LHPP表達水平也預示著腫瘤嚴重程度和總生存率降低，LHPP可能是一種新的人類抑癌因子。之后不斷有文獻報道了LHPP作為腫瘤抑制因子參與調控膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌及腎癌等惡性腫瘤的發展過程[6-8,20]。由此可見，LHPP與腫瘤的相關性及其在腫瘤中發揮的作用值得進一步研究。

本研究結果首先表明LHPP在CCA細胞中的表達降低，通過在低表達的TFK-1和HuCCT-1細胞中過表達LHPP，CCK-8實驗結果顯示在過表達LHPP的CCA細胞中，48和72 h時所測得OD值較NC組細胞低；克隆形成實驗結果同樣顯示，在CCA細胞中過表達LHPP后，細胞的克隆形成能力減弱。這些結果提示，過表達LHPP能抑制CCA細胞的增殖能力。

AKT信號通路的級聯反應改變在癌癥細胞的增殖、凋亡及轉移等過程中發揮了重要作用，例如，AKT信號通路激活促進結直腸癌的轉移進程，而AKT通路的失活是誘導人乳腺癌細胞凋亡的關鍵[21-22]。本研究結果表明，在過表達LHPP的CCA細胞中，p-AKT蛋白表達下調，AKT蛋白表達無明顯改變，這似乎提示LHPP可能通過調節p-AKT的表達而參與調控CCA細胞的增殖作用。抑癌基因功能缺失是癌癥發生的重要機制，其中，抑癌基因P53功能缺失是人類癌癥中最常見的基因事件，P53突變是包括CCA在內的多種癌癥發生的重要過程[23-25]。本研究通過對不同組CCA細胞中P53蛋白進行檢測發現，在過表達LHPP的CCA細胞中P53蛋白表達增加，這表明，LHPP可能通過促進P53表達而發揮抑制CCA細胞的增殖作用。

綜上所述，在CCA細胞中，過表達LHPP能抑制細胞的增殖作用，其發生機制可能與下調p-AKT蛋白表達和上調P53蛋白表達有關。但本研究僅局限在體外探討了LHPP對CCA細胞的增殖作用及機制，對于在機體內復雜因素影響下，LHPP在CCA中的作用及機制仍有待進一步研究，LHPP有望成為治療CCA新的作用靶點。