黃連素聯合吉西他濱對胰腺癌PANC-1細胞增殖及凋亡的影響*

宋春灼， 李想， 李俊俊， 劉猛， 付立躍， 朱海濤*

(1.貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 臨床醫學院, 貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，患者的5年生存率低于5%[1-2]。胰腺癌患者的預后差的原因部分歸因于局部腫瘤侵襲和遠處轉移、腫瘤的極端耐藥等[3]。吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前胰腺癌化療“金標準”中的首選藥物之一[4]， 但晚期胰腺癌患者在治療過程中極易對GEM產生耐藥，單用GEM在臨床治療中的效果并不理想，患者的中位生存期僅約4～6個月[5-6]。因此，尋找新的藥物聯合GEM應用在胰腺癌的臨床治療中非常重要。近年來，隨著對中藥研究的不斷加深，已發現大黃素、苦參堿等對胰腺癌具有抗腫瘤作用[7-8]。黃連素(berberine，BBR)又名小柴堿，是從黃連、黃柏等植物中提取的一種藥用價值很高的化合物，具有抗炎、降脂、降糖以及抗氧化等多種藥理作用[9-12]；有報道黃連素被用于肺癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中，且具有抗腫瘤作用[13-15]，張勁等[16]研究表明黃連素通過增加Caspase-3表達促進胰腺癌細胞的凋亡。因此，本研究將BBR以及BBR聯合GEM作用于胰腺癌PANC-1細胞，觀察兩種用藥方式在體外對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人胰腺癌細胞株PANC-1購自中國科學院干細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 GEM(美國Selleck Chemicals公司)、BBR(美國Sigma公司)、DMEM高糖培養基、0.25%胰酶溶液(美國Gibco公司)、胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，美國Hycione公司)、CCK-8細胞毒性試劑盒(上海Dojido)、細胞裂解液、4%多聚甲醛、0.01%結晶紫(廣州Affinity)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗人B細胞白血病/淋巴瘤2凋亡調節因子(Bcl-2)單克隆抗體、兔抗人B淋巴細胞瘤-2相關蛋白X(BAX)單克隆抗體(武漢Proteintech Group)、山羊抗兔二抗(武漢Boster)，371型恒溫細胞培養箱、多功能酶標儀(美國Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及藥物配置 人胰腺癌PANC-1細胞在含10% FBS的DMEM高糖培養基中培養，于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中，細胞融合度達90% 時進行傳代處理，取對數生長期的細胞進行后續實驗。BBR和GEM均用 DMSO 配制成 10 mol/L的母液放置于-20 ℃冰箱中儲存，用時以DMEN高糖培養基稀釋成各個濃度的工作液使用。

1.2.2篩選最佳藥物濃度 取對數生長期的PANC-1細胞，用胰酶消化制備細胞懸液并計數；于96孔板中每孔種植 5×103個細胞，每組5個復孔，另設一組只加DMEM高糖培養基作為調零組。待細胞貼壁后，將細胞分為對照1組(未處理)、12.5 μmol/L BBR組、25.0 μmol/L BBR組以及50.0 μmol/L BBR組，48 h后吸去培養基，向每孔中加入配置好的含CCK-8的溶液110 μL(DMEM培養基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10),在培養箱中繼續孵育2 h后，于酶標儀450 nm波長下讀取各孔吸光度值(optical density,OD值)，并計算各組細胞的抑制率及藥物對細胞的半數抑制濃度(IC50)。細胞抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值) / (對照組OD值-調零組OD值) ]×100%，藥物對PANC-1細胞的IC50是在GraphPad 8.3軟件中通過藥物各濃度對細胞的抑制率構建非線性回歸函數公式得出。在研究GEM單藥作用時，細胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的GEM處理細胞48 h，后續操作同黃連素單藥應用。在研究BBR聯合GEM作用時，根據BBR藥物對PANC-1細胞的IC50，選取25.0 μmol/L BBR進行聯合用藥實驗；細胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L GEM聯合25.0 μmol/L BBR處理細胞48 h，后續操作同上。應用金氏計算公式計算藥物協同指數(q值)，q=EA+B/[EA+(1-EA)×EB]，其中EA、EB分別表示A藥物和B藥物單獨使用時對細胞的抑制率，EA+B表示A藥物和B藥物聯合使用時對細胞的抑制率。q>1.15時表示藥物存在協同效應。根據計算的q值選擇協同抑制效果最佳的藥物濃度組合進行后續實驗。

1.2.3分組 根據GEM和BBR對PANC-1細胞的IC50值以及各藥物濃度組合的q值，將細胞分為對照2組(未處理)、GEM組(1.0 μmol/L GEM)、BBR組(25.0 μmol/L BBR)以及聯合組(25.0 μmol/L BBR聯合1.0 μmol/L GEM)。

1.3 觀察指標

1.3.1細胞克隆形成數 取對數生長期的 PANC-1 細胞，胰酶消化制備細胞懸液并計數，在 6孔板中每孔種值1×103個細胞；細胞貼壁之后，按上述分組處理PANC-1細胞，待 12 d后吸去皿里的培養基，用4%的多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，烘干，拍照并計算各組細胞的克隆數。

1.3.2Bcl-2和BAX蛋白表達 收集各組細胞，用含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制劑的細胞蛋白裂解液裂解30 min，超聲破碎10 s，以12 000 r/min在4 ℃下離心10 min，收集上清蛋白液；在蛋白液中加適量 5×loading buff在100 ℃下變性10 min；取50 μg 蛋白上樣，用10%的丙烯酰胺凝膠經100 V恒定電壓電泳2 h、250 mA 恒定電流轉膜90 min至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用含5%的脫脂奶粉在常溫下封閉 2 h；分別加入稀釋度為 1 ∶1 000 的Bcl-2、BAX和GAPDH一抗，4 ℃過夜后，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌 3 次，加入稀釋度為1 ∶5 000 二抗室溫孵育 2 h，滴加高敏曝光液在 Bio-rad成像系統中曝光。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 最佳藥物濃度

CCK-8結果顯示，BBR在PANC-1細胞中的IC50為39.92 μmol/L(圖1A)，GEM對PANC-1細胞IC50為29.07 μmol/L；25.0 μmol/L BBR聯合不同濃度GEM作用時，其對PANC-1細胞IC50為1.604 μmol/L。通過金氏公式計算得出，25.0 μmol/L BBR聯合GEM(0.1、1、10、100 μmol/L)共同作用時，q值分別為1.08、1.42、1.26、1.18，見圖1B。其中，25.0 μmol/L BBR聯合1.0 μmol/L GEM作用時協同抑制效果最佳，此聯合濃度用于后續研究。

注：A為BBR單藥對細胞的抑制率，B為GEM單藥或聯合BBR對細胞的抑制率。

2.2 克隆形成數

克隆形成數研究結果顯示，與對照組相比，隨著BBR濃度增加，細胞克隆數形成逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A、圖2B。與對照組相比，GEM組、BBR組和聯合組的PANC-1細胞克隆形成數均減少，且聯合組細胞克隆形成減少較GEM組和BBR組更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2C、圖2D。

2.3 PANC-1細胞中Bcl-2和BAX蛋白表達

與對照組相比，隨著BBR濃度的增加，Bcl-2表達逐漸降低， BAX表達逐漸增加(P<0.05)，見圖3A～圖3C。與對照組相比，GEM組、BBR組和聯合組細胞中Bcl-2表達降低，BAX表達增加，且聯合組細胞中Bcl-2蛋白表達降低及BAX蛋白表達增加較GEM組和BBR組均更明顯(P<0.05)，見圖3D～圖3F。

注：A為不同濃度BBR處理的細胞蛋白結果，B為Bcl-2相對表達量，C為BAX相對表達量，D為BBR、GEM及聯合用藥處理的細胞蛋白結果，E為Bcl-2相對表達量，F為BAX相對表達量；(1)與對照1組或2組比較，P<0.05；(2)與聯合組比較，P<0.05。

3 討論

對于不能進行手術切除治療的晚期胰腺癌患者，化療發揮了極其重要的作用。GEM作為目前晚期胰腺癌治療的一線化療藥物，主要作用于細胞分裂的G1/S期，通過抑制DNA合成、修復及誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤的作用[17-19]。然而，胰腺癌的發展是一個建立在遺傳和表觀改變基礎上的多步驟過程，隨著疾病不斷發展，晚期胰腺癌患者即使采用全身性支持治療，效果仍不理想，且患者在治療后期可能會出現對GEM耐藥的情況[20]。因此，目前臨床治療晚期胰腺癌患者的主要策略是將GEM與其他細胞毒性藥物或靶向藥物聯用，以降低患者對GEM耐藥的發生[21-23]。這意味著尋找一種或多種新的藥物聯合GEM應用尤為重要。

BBR在多種惡性腫瘤中發揮抗腫瘤作用，其抗腫瘤機制包括調節細胞自噬、調控細胞周期、抑制細胞增殖及增強藥物敏感性等[24]。在本實驗中，重點研究應用BBR單藥以及聯合GEM應用對胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響，用不同濃度BBR(12.5、25.0、50.0 μmol/L)在體外作用于人胰腺癌PANC-1細胞，CCK-8、克隆形成等實驗結果表明BBR能抑制胰腺癌細胞增殖，且抑制細胞增殖的能力與劑量呈依賴關系；接下來，本實驗還探究了在胰腺癌中BBR與GEM聯用的可能性，通過計算BBR單藥應用在PANC-1細胞中的IC50值，選取25.0 μmol/L BBR與不同濃度GEM聯合應用，并通過金氏公式計算得出，25.0 μmol/L BBR聯合GEM(1.0、10.0、100.0 μmol/L)時均發揮協同作用抑制胰腺癌細胞增殖，且在25.0 μmol/L BBR聯合1.0 μmol/L GEM時協同作用最佳。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡過程，主要受以Bcl-2家族和caspase3家族為主的多基因調控[25-26]。Bcl-2 和BAX是Bcl-2家族的成員，主要通過改變線粒體膜上電位，釋放下游相關促凋亡因子，促發caspase級聯反應，從而誘導細胞凋亡[27-28]。課題組前期研究發現，GEM能通過上調BAX蛋白表達促進胰腺癌細胞凋亡[29]。李舒等[30]研究表明，BBR能通過下調Bcl-2及上調BAX蛋白表達促進人胃癌細胞SGC7901的凋亡。因此，本研究檢測不同處理組PANC-1細胞中Bcl-2及BAX蛋白表達情況，結果表明，BBR聯合GEM能顯著下調細胞中Bcl-2蛋白表達及上調BAX蛋白表達，提示BBR聯合GEM作用可以通過調節細胞中Bcl-2及BAX蛋白表達，從而誘導胰腺癌細胞發生凋亡。

綜上所述，BBR能抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖并促進凋亡，且與GEM聯用能發揮協同作用，能增強GEM單藥應用的敏感性，使抑制細胞增殖和誘發細胞凋亡的能力增強。BBR有望成為GEM治療胰腺癌的有效聯合藥物之一。