Toll樣受體及細胞因子表達水平與腸道病毒感染患兒臨床表型的相關性分析

楊穎 周映兒 崔芬芬 陳燕 楊愛平

人腸道病毒（HEV）為單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科，腸道病毒屬，抗原具有高度多樣性，患兒感染后臨床表型多樣化［1］，首診常見急性上呼吸道感染、手足口病、皰疹性咽頰炎、口腔炎、支氣管肺炎、急性扁桃體炎、急性咽峽炎、高熱驚厥等癥狀，嚴重者可出現無菌性腦炎、急性弛緩性麻痹、無菌性腦膜炎等中樞神經癥狀，甚至死亡［2-3］。HEV感染后患兒多樣化的臨床癥狀與個體的遺傳多樣性有關［4-5］，宿主固有免疫在抗病毒感染的過程中起著至關重要的作用。機體固有免疫系統通過模式識別受體（PRR）可快速識別病原微生物相關分子而觸發免疫反應，構成機體免疫系統抗感染的第一道防線，并進一步誘導產生適應性免疫［6-7］。Toll樣受體（TLR）為宿主細胞識別病毒的PRR，其單核苷酸多態性與多種病毒的感染及預后相關，TLR7為識別HIV病毒、丙肝病毒感染的主要PRR［8］，但TLR7基因多態性與腸道病毒感染的相關性尚不清楚。本研究旨在探討TLR7基因rs3853839位點單核苷酸多態性、細胞因子水平與兒童腸道病毒感染后不同臨床表型的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月至2018年12月浙江蕭山醫院醫共體兒童門診及住院部的腸道病毒感染患兒200例，所有患兒咽拭子均采用通用引物檢測試劑盒（湖南圣湘）檢測驗證。另選取同期浙江蕭山醫院醫共體總院兒保科門診體檢兒童100例作為對照。腸道病毒感染患兒組，男103例、女97例，年齡（26.4±9.2）個月；對照組，男50例、女50例，年齡（25.6±8.3）個月。兩組研究對象的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P>0.05）。根據《手足口病診療指南（2013 年版）》［4］的診斷標準將手足口病患兒分為輕癥組和重癥組，輕癥僅有發熱伴手、足、口、臀部皮疹表現；重癥組在輕癥組臨床表現的基礎上合并出現肺水腫、肺出血、腦膜炎、腦炎、脊髓炎、腦脊髓炎、心力衰竭等其中至少1項并發癥。本研究經浙江蕭山醫院醫共體總院醫學倫理委員會批準，所有患者法定監護人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 （1）腸道病毒分子診斷：參照湖南圣湘（批號：2019007）試劑盒說明書提取和擴增腸道病毒HEV、CA-71、CA-16，根據試劑盒說明書提供的擴增程序用ABI7500進行定性檢測。（2）腸道病毒 RNA提取及逆轉錄：參照Qiagen 公司（貨號：DP419）提取病毒RNA，Takara逆轉錄試劑盒（貨號：RR037A）說明書配制反應體系及擴增程序。（3）腸道病毒分型檢測：病毒核酸檢測陽性的標本根據文獻合成測序引物，擴增產物送至上海生工生物工程公司進行測序，將測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，并與Genebank數據庫中的序列進行比對分析，得出腸道病毒的分型結果。（4）基因組DNA提取：Ficoll密度梯度分離外周靜脈血PBMC，用包含10%二甲基亞楓（DMSO）的胎牛血清重懸后液氮保存；參照ThermoFisher公司（貨號：10503027）試劑盒說明書提取PBMC中人基因組，測定濃度后分裝，-80 ℃保存備用。（5）SNP位點篩選：從美國國立生物技術信息中心（NCBI）數據庫和HapMap數據庫中篩選漢族人群TLR7基因相關SNP，所選SNP最小基因頻率（MAF）>0.05、遺傳平衡（Hardy-Weinberg）檢驗（P>0.05）、基因分型成功率>90%，rs3853839作為本研究的檢測位點。（6）TLR7的SNP分析：用TaqMan探針實時熒光PCR對2個SNP進行基因分型，所用引物和探針序列見表1，熒光定量PCR參照試劑盒（美國ThermoFisher公司）操作說明配制反應體系及擴增程序，每個反應設3個復孔。（7）淋巴細胞及細胞因子檢測：參照BD FACSCantoⅡ流式細胞儀及試劑說明書分離檢測全血淋巴細胞五項細胞因子。

表1 SNP信息及其引物和探針序列

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗TLR7基因SNP位點的分布情況，非條件Logistic回歸分析SNP基因型與EV71感染之間的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 TLR7基因rsl79019與rs3853839兩位點基因型在腸道病毒感染組和健康對照組的分布處于遺傳平衡狀態。

2.2 主要感染型別及臨床表現 腸道病毒測序分析分型結果，EV71型17例（8.5%）、CoxA16型35例（17.5%）、CoxA6型57例（28.5%）、CoxA10型44例（22.0%），其他腸道病毒型47例（23.5%）；腸道病毒感染的主要臨床表現為上呼吸道感染、手足口病及皰疹性咽峽炎、支氣管肺炎；腦炎/無菌性腦膜炎組主要見于EV71感染（P<0.05）。

2.3 腸道病毒感染患兒外周血T淋巴細胞亞群的變化 相較于輕癥組，重癥組患兒CD4+、CD3+淋巴細胞及NK細胞數量出現明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；B淋巴細胞數量組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 三組淋巴細胞檢測結果

2.4 腸道病毒感染患兒的外周血細胞因子水平 腸道病毒感染重癥組患兒血清中IL-10、IL-6、IFN-γ水平顯著高于輕癥組，差異有統計學意義（P<0.05）；重癥組與輕癥組的血清TNF、IL-2、IL-4表達水平無顯著性差異。見圖2。

圖2 輕癥組與重癥組腸道病毒感染患兒細胞因子水平檢測結果

2.5 TLR7基因rs3853839位點SNP與患兒不同臨床表型分布 腦炎/無菌性腦膜炎重癥組女性rs3853839基因型GC和CC的頻率明顯高于輕癥組（手足口病、皰疹性咽頰炎、上呼吸道感染、支氣管肺炎）（χ2=5.438、5.762、7.094、6.116，P<0.05），見表2。感染EV71患者組TLR7基因rs3853839位點C基因型的頻率明顯高于其它確診型別組（CoxA6、CoxA10、CoxA16）（χ2=3.82、4.036、5.879，P<0.05），見表3。

表2 腸道病毒感染患兒不同首診臨床表型與健康對照組rs3853839基因SNP基因型分布［n（%）］

2.6 TLR7基因rs3853839位點SNP與不同腸道病毒型別 女性EV71感染者rs3853839基因型GC和CC的頻率明顯高于CoxA6、CoxA10、CoxA16（χ2=3.962、3.938、6.517，P<0.05）；男性EV71感染患者rs3853839基因型CC和GG的頻率與CoxA6、CoxA10、CoxA16比較，差異無統計學意義（χ2=0.816、0.814、1.461，P=0.366、0.367、0.227）。見表3。

表3 腸道感染患者不同型別與TLR7基因rs3853839位點SNP分布［n（%）］

3 討論

腸道病毒引發的疾病譜較廣，臨床癥狀多樣化，同一型別腸道病毒可能導致不同的臨床表現，不同型別腸道病毒感染亦可導致相似的臨床表現。國內外均有報道指出，不同基因型別的腸道病毒感染與患兒差異化臨床表現具有一定的相關性［9-10］。研究顯示，引起我區夏季兒童急性呼吸道感染的主要病毒類型HEV為CoxA6，其次是CoxA10，這兩型優勢HEV感染的主要臨床表現除呼吸道感染外，還包括皰疹性咽炎、手足口病，與國內其他學者的報道存在一定差異。深圳地區引起兒童夏季呼吸道感染的優勢HEV主要是CoxA6，其次是CoxA16；上海市主要是CoxA2、CoxA5和CoxB5，上海市松江地區主要是CoxB3，其次是CoxA4；浙江省湖州地區主要是CoxA6，其次是CoxA2［11-13］。由此可見，不同地區優勢CoxA血清型存在較大差異，提示腸道病毒的流行型別有明顯地區差異。另外，周俊等［14］于2014年研究揭示杭州地區EV71、CoxA16病毒感染的陽性率依次為39.5%、10.2%，與本研究存在一定差異，提示同一地區腸道病毒流行型別可能隨時間變遷而不同。

CD4/CD8的比值可反應輔助性T細胞與抑制性T細胞之間的平衡，機體健康狀況下兩者互相制約從而保持平衡［15］。本研究中腸道病毒感染患兒外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞數量及CD4/CD8的比值均顯著降低，提示腸道病毒感染后機體存在細胞免疫功能的紊亂。此外，IL-10、IFN-γ等細胞因子水平在腸道病毒感染重癥患兒急性期明顯升高，經治療后恢復期的細胞因子水平也隨之下降。IL-10、IFN-γ在重癥腸道病毒的呼吸道感染及病情進展中起著重要作用，其異常增高可以預測感染所致臨床癥狀的重癥化傾向，可用于幫助干預重癥患者的治療，作為監測病毒感染的嚴重程度一項指標。

因為病毒感染引發的人體免疫反應主要依賴于淋巴細胞，TLR7識別并結合HEV基因組RNA后，激活信號級聯反應、啟動固有免疫起到抗病毒感染作用［13］。研究表明，rs3853839等位基因G在女性HCV持續感染者中為保護性因素，于男性感染者并無上述作用，性別差異可能與雌雄激素參與女性固有免疫和適應性免疫有關［16］。TLR7位于X染色，按性別進一步分析顯示女性EV71感染者rs3853839基因型GC和CC的頻率明顯高于CA6、CA10、CA16（P<0.05），男性則無上述結果，此種性別差異可能與雌激素介導的女性固有免疫和適應性免疫有關［17］。

本研究尚存在以下幾點不足：病例資料僅來源于杭州市蕭山區，可能不具有廣泛代表性；實驗組準入無統一標準，HEV陽性患兒可能無法排除合并實驗室檢查外的其它病毒感染；其它HEV型別與男女陽性率存在差異；有待后續研究進一步完善。此外，新型腸道病毒所致的呼吸道感染也值得兒科醫生重視。