載miR-30a超聲微泡對乳腺癌細胞上皮-間質轉化進程的影響

葉蘭 凌晨

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率占所有惡性腫瘤的9%～10%，惡性程度與腫瘤轉移是造成患者死亡的主要原因。惡性腫瘤的轉移進程中上皮-間質轉化（EMT）發揮著關鍵的調節作用，癌細胞表型發生頻繁的暫時性、異質性改變，表觀遺傳調控可部分解釋癌細胞表型靈活轉變的特性，其中microRNAs（miRNAs）的轉錄后調控機制起著重要作用［1-2］。miR-30a可通過靶向ZEB2［3］和SLUG［4］抑制乳腺癌細胞的惡性轉化以及EMT進程。超聲（US）成像技術是一種實時成像技術，造影劑微泡優先分布于腫瘤中豐富的微血管，從而進行腫瘤顯影［5］。近年來，超聲靶向微泡破壞（UTMD）作為藥物和基因的遞載系統，體現出巨大的潛力，引起眾多研究者的重視。筆者擬利用UTMD技術在體外研究miR-30a遞載進入乳腺癌細胞后對癌細胞EMT進程的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購于中科院上海細胞庫，細胞貼壁培養于含15%胎牛血清的L-15培養液中，在37 ℃、5% CO2的細胞恒溫培養箱中常規培養。

1.2 試劑與儀器 SonoVue購于博萊科公司，細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，Bcl-2抗體、Ki-67抗體、cl-caspase-3抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體、Slug抗體、GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，熒光素酶報告質粒載體由南京金斯瑞生物科技公司構建，流式細胞分析儀購自美國BD Bioscience公司，實時熒光定量PCR為瑞士Roche公司生產，Envision分析儀由美國PerkinElmer公司生產。

1.3 微泡制備和UTMD轉染 SonoVue瓶內注射5 mL無菌生理鹽水，振蕩至全部分散。6孔板培養MCF-7細胞，按照次日達到70%接種密度進行傳代培養，過夜培養后，用SonoVue進行轉染，分為4組，每組3孔細胞。Cells組：無處理；Cells+US+miR-30a組：細胞中加入50 nM miR-30a，均勻分散后，以1 MHz頻率、1 W/cm2輻照功率超聲30 sec；Cells+MB+miR-30a組：細胞中加入等量 miR-30a，加入20%原始濃度SonoVue；Cells+UTMD+miR-30a組：細胞中加入等量miR-30a和SonoVue，以1 MHz頻率、1 W/cm2輻照功率超聲30 sec。

1.4 實時熒光定量PCR實驗 采用SYBR Green熒光定量PCR法檢測miR-30a和Slug的基因含量，嚴格按照Invitrogen說明書進行操作，Trizol試劑提取總RNA，經逆轉錄成cDNA后，對各基因表達量進行檢測，引物由蘇州瑞贏生物公司合成。miR-30a引物 上 游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'，下游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'， 以U6為內參，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'，下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。Slug引 物上 游：5'-TCCTGGTCAAGAAGCATT-3'，下 游：5'- GAGGAGGTGTCAGATGGA-3'，以ACTB為內參，上游： 5'-ACTCGTCATACTCCTGCT-3'，下 游：5'-GAA ACTACCTTCAACTCC -3'。采用2-ΔΔt法計算目標基因相對內參基因的相對倍數，各實驗均重復3次。

1.5 細胞凋亡檢測 各組加藥處理48 h后，采用胰蛋白酶收集懸浮細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，以流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比，計算早期、晚期凋亡率之和，實驗重復3次。

1.6 目的蛋白的Western Blot檢測 采用胰蛋白酶收集細胞，經細胞裂解液冰上裂解后，再經BCA試劑盒測定總蛋白濃度。每組取30 μg蛋白經變性和loading后，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，再經PVDF轉膜蛋白印跡。用5%脫脂奶粉封閉后，再經一抗孵育過夜（4 ℃），再經二抗室溫孵育1 h，加ECL顯影液顯色，再由成像分析儀測量各條帶光密度，計算各條帶相對內參蛋白的相對表達水平。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 根據miR-30a和Slug 3'-UTR結合位點設計wt Slug 3'-UTR和mut Slug 3'-UTR，克隆至熒光素酶報告質粒載體psiCHECK2上，然后將其和miR-30a mimic、miR-NC共同轉染到MDAMB-231細胞中，按照lipofectamin3000試劑盒說明書進行操作。轉染24 h后，檢測海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性值的比值，作為miR-30a同Slug的結合力。

1.8 Transwell細胞侵襲實驗 采用胰蛋白酶消化各組細胞，調整至105個/孔，每個小室的上室（含基質膠）內加入100 μL細胞，下室內加入700 μL完全培養液，過夜培養后用棉簽拭去上室上表面細胞，下表面經甲醇固定、結晶紫染色后封片，顯微鏡下計數下表面附著的細胞，并計算相對侵襲力。

2 結果

2.1 UTMD轉染效率鑒定 采用qRT-PCR技術鑒定各組miR-30a的表達水平，結果顯示Cells+UTMD+miR-30a組的miR-30a表達水平明顯高于其他各組，差異有統計學意義（P<0.05），而Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組之間miR-30a水平無統計差異（P>0.05）。見圖1。

圖1 4組MCF-7細胞中miR-30a的表達水平

2.2 UTMD遞送的miR-30a促進MCF-7細胞凋亡 細胞凋亡結果顯示，Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組、Cells+UTMD+miR-30a組 的細 胞 凋亡率分別為（3.2±1.4）%、（4.8±2.1）%、（3.5±1.1）%、（20.2±3.2）%，Cells+UTMD+miR-30a組的細胞凋亡率顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05），其余三組之間無統計學差異（P>0.05），見圖2A。進一步檢測各組的凋亡相關和增殖相關蛋白表達，可見癌基因Bcl-2和增殖相關基因Ki-67的蛋白表達水平在Cells+UTMD+miR-30a組中明顯降低，凋亡執行者cl-caspase-3的蛋白表達水平在Cells+UTMD+miR-30a組中明顯增加，與其余三組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），而3個蛋白的表達水平在其余三組中比較無統計學差異（P>0.05），見圖2B。

圖2 4組MCF-7細胞凋亡水平和凋亡/增殖相關蛋白的表達

2.3 miR-30直接靶向結合Slug 首先采用miRanda、miRWalk和TargetScan預測miR-30a和Slug的靶向結合位點，Slug 3'-UTR包含兩處進化保守的結構域，同miR-30a具有互補性，然后對Slug 3'-UTR的結合位點進行突變，見圖3A，通過雙熒光素酶實驗證實，同時轉染miR-30a mimic和Slug-wt的細胞的熒光素酶活性最低，同其他轉染組相比差異具有統計學意義（P<0.05），見圖3B。進一步用UTMD遞送miR-30a，并檢測細胞中Slug的基因表達水平，可見同Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組相比，Cells+UTMD+miR-30a組的Slug基因表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖3C。

圖3 miR-30a同Slug 3'-UTR的靶向關系檢測

2.4 miR-30抑制細胞侵襲和EMT 與Cells組相比，Cells+UTMD+miR-30a組的細胞侵襲力顯著降低（P<0.05），而Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組無顯著變化（P>0.05），見圖4A。進一步對EMT進程標志蛋白Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平進行檢測，可見Cells+UTMD+miR-30a組中，Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），而其余3組比較差異無明顯統計學差異（P>0.05），同時，Cells+UTMD+miR-30a組的Slug蛋白表達水平也顯著降低（P<0.05）。

圖4 4組MCF-7細胞侵襲能力和EMT能力檢測

3 討論

乳腺癌的主要治療方式包括手術、放化療、靶向治療和內分泌治療等，腫瘤轉移是導致復發、治療失敗的主要原因，25%～50%的乳腺癌患者最終會出現轉移，從而增加死亡風險［6］，故而乳腺癌的轉移機制研究是研發治療藥物的基礎。隨著基因技術的發展，基因治療有可能成為治療乳腺癌的有效方法之一，但體內基因轉染的方法具有一定局限性，病毒雖然轉染效率高，但容易發生脫靶反應，有著安全性的疑慮；而質粒的分子量巨大，會造成有效劑量低、靶點效率不高。研究證實，miRNA可能對乳腺癌惡化和轉移的預測、診斷、治療及患者預后具有一定指導價值，有效劑量、靶向性等方面均具有顯著優勢，但受限于遞送方法的影響，易被體內廣泛分布的RNA酶水解。

本研究通過觀察超聲靶向微泡破壞（UTMD）技術遞送miRNA至體外人乳腺癌細胞的效果，探討miR-30a抑制乳腺癌細胞生存、侵襲的能力及其作用機制。結果顯示，單獨超聲或單獨微泡處理，并不能將miR-30a轉染進入乳腺癌細胞，但超聲和微泡聯合使用時，miR-30a可被轉染進入癌細胞，且其在細胞中的表達水平顯著提高，說明UTMD技術可以增強基因的轉染效率［7］。miR-30a表達水平的提高對乳腺癌細胞的生物功能產生一系列影響，Cells+UTMD+miR-30a組乳腺癌細胞凋亡水平上調，凋亡相關蛋白cl-caspase-3水平降低，癌基因Bcl-2蛋白和增殖相關蛋白Ki-67表達降低。研究證實，經UTMD遞送后，癌細胞內上調的miR-30a對乳腺癌細胞下游凋亡和增殖通路具有一定的影響。一項慢性髓系白血病細胞株的研究顯示，miR-30a高表達可促進K562細胞的凋亡［8］。綜前所述，miR-30a可能具有促進癌細胞凋亡的作用。本研究通過軟件預測發現，miR-30a可能同Slug 3'-UTR結合，經熒光素酶報告基因實驗證實，miR-30a直接結合于Slug 3'-UTR，并且UTMD遞送的miR-30a造成Slug基因表達和蛋白表達降低，證實Slug是miR-30a的靶點。Transwell實驗顯示，UTMD遞送的miR-30a減少了MDA-MB-231的侵襲能力。進一步檢測EMT標志蛋白證實，Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平明顯降低。在EMT進程中，癌細胞逐漸丟失上皮表型，缺乏細胞-細胞間的粘附性，增強間充質特性，表現為更強的游離性，是癌細胞轉移的重要機制。主要的EMT標志物包括上皮標記物（如E-cadherin）以及間充質標志物（如Vimentin、N-cadherin）［9］。Snail的過度表達是EMT發生的先決條件，而Slug屬于Snail家族，在腫瘤進展過程中亦會觸發EMT［10-11］。Slug抑制后可增加緊密連接蛋白CLDN表達，減少癌細胞的侵襲和轉移性，發揮調節乳腺癌EMT的作用［12］。Slug還可以通過轉錄作用激活三葉蟲FSCN基因表達，而FSCN在細胞內發揮維持絲狀偽足的作用，推測miR-30a抑制的Slug下調了MDA-MB-231細胞絲狀偽足的組裝，造成Vimentin和N-cadherin水平降低［13］。本研究結果證實，UTMD有效的遞送miR-30a進入MDA-MB-231細胞，并下調了癌細胞的EMT水平和細胞侵襲能力。

綜上，UTMD是一種有效的miRNA遞送方法，miR-30a對乳腺癌細胞EMT具有靶向抑制作用，UTMD可以通過遞送抑癌基因成為一種基因治療方法。