Holliday交叉識別蛋白表達與胃癌發生發展及其預后的關系

王立 謝鵬 賀小武 季世偉 周建平

中國是胃癌高發區［1］，>60%的胃癌患者在初診時已處于進展期，預后較差［2］。為改善胃癌預后，現丞需尋找新的分子生物學標志物，Holliday交叉識別蛋白（HJURP）位于人染色體的2q37.1上，長約17.73kb，有9個外顯子、2529個核苷酸，編碼748個氨基酸［3］，是著絲粒蛋白A的分子伴侶（CENP-A），與CENP-A結合促進CENP-A在核小體上的招募，輔助核小體裝配，若其功能不全，可能會導致腫瘤發生［4］。已有研究報道，HJURP在乳腺癌、肝癌中呈現高表達，且與不良預后相關［5-6］，但HJURP在胃腺癌中的高表達與預后并不相關［7］。本研究擬通過檢測HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達，分析其與臨床病理及預后的相關性，探討HJURP基因與胃癌之間可能存在的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月至2016年12月本院普外科收治的胃癌患者79例，胃癌根治術前均未接受放、化療等治療。其中，男58例，女21例；年齡36～83歲，中位年齡66歲；腫瘤直徑≥5 cm者26例，腫瘤直徑<5 cm者53例（若腫塊為潰瘍型，以潰瘍最外側緣為界確定腫瘤直徑）；病理組織學類型，中高分化癌51例、低分化或未分化癌28例；胃壁浸潤程度即胃壁侵犯深度，T1/T2 17例、T3/T4 62例；有淋巴結轉移58例，無淋巴結轉移21例；TNM分期參照2018年美國癌癥聯合委員會標準，Ⅰ/Ⅱ期30例、Ⅲ/Ⅳ期49例；術后病理證實脈管有癌栓者43例，無癌栓者36例；術前CEA≥5 ng/mL者63例，<5 ng/mL者16例；術后電話或門診隨訪，死亡44例，中位生存期39個月。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 收集79例胃癌患者的胃癌組織作為實驗樣本，另隨機選取同期于本院就診的胃良性疾病患者27例，收集其正常胃組織（非癌樣本旁的正常胃組織）作為對照樣本。采用免疫組化二步法檢測正常胃部組織、胃癌組織中HJURP蛋白的表達。病理蠟塊連續切片，厚度3～5 μm，3片；將切片放入60 ℃烤箱烘烤2 h；二甲苯浸泡2次，進行脫蠟，每次5 min；無水乙醇2次、95%乙醇1次、70%乙醇1次，進行水化，每次3 min；然后，純水漂洗3 min，95 ℃預熱，0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）抗原修復20 min，加入3%過氧化氫甲醇溶液靜置10 min進行阻斷，加入5%BSA封閉液室溫靜置20 min封閉，滴加HJURP一抗（1∶200）4 ℃過夜，滴加辣根酶標記的兔二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染后封片。實驗中使用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對照，HJURP一抗和辣根酶標記兔二抗均購自AbCAM 公司。病理讀片、判斷分別由一位病理科主任醫師和一位病理科副主任醫師獨立完成。

1.3 觀察指標 HJURP在胃癌組織中的表達情況，病理判讀評分：染色范圍未著色為0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分；染色強度評分范圍為0～3分；以染色強度評分與染色范圍評分的乘積作為最終評分，并據此將實驗樣本分為陰性組（0～2分）和陽性組（3～9分）。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件。計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher精準；生存曲線采用Kaplan-Meier方法評估，并用log-rank檢驗比較差異；構建單因素、多因素的Cox比例風險回歸模型預測生存期。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達 HJURP主要表達于細胞質中，見圖1。實驗樣本中陽性表達33例（41.8%），正常胃組織中陽性表達5例（18.5%），差異有統計學意義（P=0.037）。

圖1 HJURP在胃癌及正常胃組織中的表達（免疫組化染色）

2.2 HJURP表達陽性組與陰性組的臨床病理資料比較 HJURP的表達水平與胃癌組織的淋巴轉移、TNM分期、脈管有無癌栓有相關（P<0.05），而與性別、年齡、術前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤深度無關（P>0.05）。見表1。

表1 HJURP表達陽性組與陰性組的臨床病理資料比較

2.3 生存分析 79例胃癌患者的總體中位生存時間為56個月（95%CI：31.856-80.144），其中HJURP高表達患者的中位生存時間為36個月（95%CI：23.313-48.687），顯著低于HJURP低表達患者，log-rank檢驗顯示差異有統計學意義（P=0.005）。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，見圖2。單因素Cox風險回歸分析，腫瘤的胃壁浸潤深度、淋巴轉移及TMN分期、HJURP表達與生存期相關，可能是胃癌的臨床預后因子。進一步校正，納入單因素回歸分析中P<0.05的因素進行多因素Cox回歸，結果提示HJURP表達水平與腫瘤TNM分期等因素可以作為胃癌的預后因子預測患者的OS。見表2。

圖2 HJURP表達對胃癌患者生存期影響的Kaplan-Meier曲線

表2 影響胃癌患者預后的單因素、多因素Cox回歸分析

3 討論

流行病學證據顯示，環境、飲食等因素在胃癌的發生過程中起重要作用［8］。胃癌發病在世界范圍內存在較大的地理、人群分布差異，中國、日本、韓國為代表的東亞地區發病率及死亡率明顯高于北美、歐洲及非洲地區［9］。與發病率同樣高的日本、韓國相比，中國胃癌患者的5年相對生存率較低，可能是由于我國大多數胃癌患者在發現時已處于晚期，而胃癌的治療效果與首次診斷時間密切相關［10］。因此，積極發現新的分子生物學標記物，有助于提高胃癌的早期診斷率，協助臨床診療，延長我國胃癌患者的生存期。

HJURP于2007年由TATSUYA K等發現，是毛細血管擴增性共濟失調突變（ATM）通路的下游靶基因，DNA雙鏈斷裂（DBS）可以引起HJURP的表達增加，DNA損傷后HJURP參與DSB損傷修復過程中的同源重組，而DNA修復途徑中的重要成分表達異常往往會增加基因突變和腫瘤發生的機會。當HJURP表達被抑制，細胞內會出現異常的染色體融合，引起基因的不穩定性，因此認為HJURP是維持染色體穩定的一個不可或缺的因素［5］。FOLTZ等［11］研究發現在著絲粒染色質裝配過程中，HJURP是CENP-A的特異性分子伴侶。CENP-A是組蛋白H3的變異體，維持著絲粒定位并影響著絲粒的形成，對高保真染色體分離至關重要，而著絲粒的功能異常可導致染色體的異常分離，進而誘發腫瘤的發生［12-13］。近年來，HJURP表達與惡性腫瘤的相關研究陸續出現，眾多研究提示HJURP表達異常可能與腫瘤的發生與預后相關。KATO等［5］發現HJURP通過參與DSB過程，參與維持染色體的穩定及細胞永生，并觀察到HJURP表達異常與肺癌的不良預后相關。HU等［3］發現HJURP在肝細胞肝癌（HCC）組織中的表達明顯高于正常組織，且其高表達是HCC患者預后的獨立危險因素。遲鋮［7］研究發現，HJURP在胃腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，此種差異性表達與總體生存率無差別，但在未出現遠處轉移的胃腺癌患者中，HJURP高表達的胃腺癌患者總生存期明顯高于HJURP低表達的胃腺癌患者。

本研究對胃癌組織和正常胃組織的病理切片進行免疫組化染色，探討HJURP與胃癌的關系，發現胃癌組織中HJURP的表達明顯高于正常胃組織，進一步結合實驗樣本的臨床病理特征進行分析，結果提示HJURP的表達可能與胃癌組織的淋巴轉移、TNM分期、脈管有無癌栓相關，而與性別、年齡、術前CEA、腫瘤大小、分化程度、胃壁侵潤深度無關。生存分析發現，胃癌組織中HJURP基因的高表達往往與患者的不良預后相關，提示HJURP表達可能是胃癌患者預后不良的獨立預測因子，這與HU等［3，5］研究HJURP在肝癌等腫瘤中的表達結果一致，但與遲鋮［7］研究HJURP在胃腺癌中的表達結果相悖，此種差異是否與入組患者的疾病分期、病理分型等不同因素相關，仍有待進一步深入研究。

綜上，HJURP未來可能會成為預測胃癌患者預后的一個重要指標，可通過檢測胃癌患者的HJURP表達，積極協助臨床診療以獲得更好的預后，甚至基于此分子基因靶點進行胃癌靶向治療相關分子通路及藥物的探索，為胃癌的治療提供新思路。