鄢少聰，應學明，趙建華，汪茜

景德鎮市第一人民醫院腫瘤科，江西 景德鎮 333000

據國家癌癥中心統計，2013年結直腸癌新增病例達60 900例，位居第4位。由于早期診斷困難，且容易復發轉移等因素，很大部分患者預后較差，而腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）雖具有一定的預測價值，但也僅作為參考。近年來，循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）檢測在多種實體腫瘤中得到了應用，已被證實其計數的動態變化與腫瘤的療效、復發、轉移等具有一定相關性。磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一個具有特異性磷酸酶活性的抑癌基因，能抑制腫瘤轉錄，與腫瘤病理分化及預后相關。本研究通過檢測CTC及PTEN基因表達，探討其與臨床特征和預后的關系，為CTC及PTEN基因檢測在預后判斷和復發監測等方面提供依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2019年1月景德鎮市第一人民醫院腫瘤科收治的77例術后Ⅲ期結直腸癌患者。納入標準：①年齡≥18歲；②術后病理檢查明確診斷為Ⅲ期結直腸癌；③術前未行任何治療；④體力狀態評分為0～2分。排除標準：①既往有其他惡性腫瘤病史；②一般情況差不宜行抗腫瘤治療；③不宜參加本試驗。其中，男性51例，女性26例；年齡24～75歲，平均（54.0±3.5）歲；結腸癌40例，直腸癌37例；T期22例，T期40例，T期15例；N期57例，N期20例；分化程度：中分化43例，低分化34例。本研究經醫院倫理學委員會批準，患者自愿參與并知情同意。

1.2 檢測方法

于首次治療前2 h采集患者外周血5 ml，采用CanpatrolCTC二代技術，用免疫磁珠負向去除外周血中白細胞，然后通過納米膜過濾檢出CTC，再對每個CTC進行分型，同時采用多重mRNA原位分析技術標記檢測PTEN基因。

1.3 結果判斷

細胞內CD45（-）、EpCAM（+）以及 CK8/18/19（+），顯微鏡下看到紅色熒光信號，為上皮型CTC；細胞內同時見到綠色熒光和紅色熒光信號，為混合型 CTC；細胞內 CD45（-），Vimentin（+）以及Twist（+），顯微鏡下可見綠色熒光信號，為間質型CTC（圖1）。人工計數CTC個數，定義CTC計數≥3為CTC陽性。每例患者CTC中PTEN基因的表達程度分為3個等級：信號點1～2點為低表達，3～8點為中表達，≥9點為高表達。

圖1 熒光顯微鏡下的CTC分型

1.4 隨訪

制訂病例觀察表，記錄患者的臨床資料。從入組時間開始計算，每3個月復查，隨訪內容包括肛門指診、血CEA、胸腹部CT，直腸癌患者可復查盆腔MRI；1年內進行結腸鏡檢查。采用以患者復診為主加電話聯系的隨訪方式，隨訪至患者死亡、失訪或2020年6月30日，其中5例患者失訪。

1.5 統計方法

采用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC與臨床特征的關系

低分化結直腸癌患者CTC陽性率明顯高于中分化患者，且隨著T分期升高CTC陽性率升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；不同性別、年齡、腫瘤部位、CEA水平、N分期結直腸癌患者的CTC陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的結直腸癌患者CTC情況的比較（n=77）

2.2 CTC分型與腫瘤臨床分期及分化程度的關系

不同T分期、分化程度的結直腸癌患者上皮型CTC比例比較，差異均有統計學意義（χ=8.131、8.545，P＜0.05）；不同T分期、N分期的結直腸癌患者混合型CTC比例比較，差異均有統計學意義（χ=9.994、7.036，P＜0.05）；不同分化程度的結直腸癌患者間質型CTC比例比較，差異有統計學意義（χ=6.338，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床分期及分化程度結直腸癌患者的CTC分型

2.3 CTC與PTEN基因的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，CTC與PTEN基因表達水平呈負相關（P＜0.01）。（表3）

表3 CTC與PTEN基因的相關性分析

2.4 CTC陽性與陰性患者生存情況的比較

CTC陰性組患者的中位生存時間（overall sur-vival，OS）為19個月，明顯長于CTC陽性組的14個月，差異有統計學意義（χ=11.608，P＜0.01）。CTC陰性組的中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）為11個月，明顯長于CTC陽性組的7個月，差異有統計學意義（χ=8.082，P＜0.01）。（圖2、圖3）

圖2 CTC陰性組（n=32）與陽性組（n=45）患者的OS曲線

圖3 CTC陰性組（n=32）與陽性組（n=45）患者的PFS曲線

2.5 不同分型CTC陽性患者與陰性患者生存情況的比較

上皮型、混合型CTC陰性組與陽性組患者的中位OS及中位PFS比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖4～圖7）。間質型CTC陰性組患者的中位OS為19個月，長于陽性組患者的15個月，間質型CTC陰性組患者的中位PFS為11個月，長于陽性組患者的7個月，差異均有統計學意義（χ=4.679、5.324，P＜0.05）（圖8、圖9）。

圖4 上皮型CTC陰性組（n=50）與陽性組（n=27）患者的OS曲線

圖5 上皮型CTC陰性組（n=50）與陽性組（n=27）患者的PFS曲線

圖6 混合型CTC陰性組（n=21）與陽性組（n=56）患者的OS曲線

圖7 混合型CTC陰性組（n=21）與陽性組（n=56）患者的PFS曲線

圖8 間質型CTC陰性組（n=44）與陽性組（n=33）患者的OS曲線

圖9 間質型CTC陰性組（n=44）與陽性組（n=33）患者的PFS曲線

2.6 PTEN基因低表達與中表達患者生存情況的比較

PTEN基因低表達患者的中位OS為10個月，明顯短于中表達患者的19個月，差異有統計學意義（χ=23.676，P＜0.01）。PTEN基因低表達患者的中位PFS為5個月，明顯短于中表達患者的11個月，差異有統計學意義（χ=17.644，P＜0.01）。（圖10、圖11）

圖10 PTEN低表達組（n=13）與中表達組（n=30）患者的OS曲線

圖11 PTEN低表達組（n=13）與中表達組（n=30）患者的PFS曲線

3 討論

近年來，結直腸癌的發病率呈上升趨勢，且在發達國家中的發病率明顯高于發展中國家。早診斷、早治療、預后監測是提高腫瘤患者生存率、降低病死率的關鍵。CTC攜帶有原發腫瘤組織或轉移灶的表型和遺傳型，痕量存在于外周血中，取樣便捷。越來越多研究表明，CTC檢測可成為一種新型、非創性的診斷方法，是精準醫療的一個重要研究方向，在臨床上發揮重要作用。既往研究顯示，通過CellSearch系統檢測外周血CTC是最常用的方法之一。但采用該檢測系統無法富集到間質型CTC，因此，存在一定的局限性。本研究采用CanpatrolCTC二代技術，用免疫磁珠負向去除外周血中白細胞，然后通過納米膜過濾檢出CTC，同時根據上皮-間充質相關標志物的表達情況，采用RNA-ISH對CTC進行分型鑒定，使早期腫瘤精準診斷成為可能。

本研究共納入術后Ⅲ期結直腸癌患者77例，有63例患者檢出了CTC，檢出率達81.8%，與Zhao等研究的檢出率86.9%相近。有數據顯示，當Cut-off值為3時，CTC檢測可對患者良惡性作出較好區分，因此，本文亦采用3為Cut-off值，陽性率為58.4%（45/77），說明腫瘤細胞在早期就已存在于患者血液中，并可能出現轉移，而TNM分期無法早期預判腫瘤的微轉移，這也提示Ⅲ期患者需要進行充分的輔助治療。

本研究發現，隨著T分期升高，CTC陽性率升高，差異有統計學意義，與其他學者的結果相似，證實CTC與腫瘤侵犯深度有明顯的相關性。研究發現CTC的檢出率與病理分期有顯著的相關性。另外，本研究結果顯示，腫瘤分化程度低，CTC陽性率則高，差異有統計學意義，這與既往研究結果不一致，需擴大樣本進一步證實。CEA是結直腸癌診斷和監測治療反應的重要標志物，高CEA水平可能與結直腸癌進展相關，也有研究顯示，CEA異常組CTC陽性率也高于CEA正常組，本研究中CTC與CEA并無相關性。對CTC分型后，統計出上皮型、混合型、間質型CTC比例分別為35.1%、72.7%、42.9%，并發現，不同T分期、N分期的結直腸癌患者混合型CTC比例比較，差異均有統計學意義；不同分化程度的結直腸癌患者間質型CTC比例比較，差異有統計學意義。這項結果既往未見報道，而這和CTC與患者臨床特征的關系大致相符。

多項研究提示CTC可以作為轉移性結腸癌患者的預后指標。Gennaro等也發現，CTC＜3的結直腸癌患者3年PFS長于CTC≥3者。在本研究中，CTC陰性組患者中位PFS和中位OS均明顯長于CTC陽性組，差異均有統計學意義，說明CTC是與Ⅲ期結直腸癌患者生存時間密切相關的指標，但能否作為臨床預后的決定性因素，還需要進一步研究。對CTC分型后，研究發現，在乳腺癌中，隨著病情的不斷惡化，間質型細胞比例會隨之升高，在肝細胞肝癌中，轉移患者的間質型CTC陽性率明顯高于無轉移患者，提示間質型CTC具有較強的轉移侵襲及抗凋亡能力。本研究結果顯示，在結直腸癌患者中，僅間質型CTC陰性組和陽性組患者的生存時間有顯著差異，這與間質型CTC的侵襲能力密切相關，也說明間質型CTC可能是影響腫瘤患者預后的主要CTC類型。

PTEN基因通過與多種基因協同作用抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路，抑制腫瘤細胞轉錄。研究表明，PTEN與細胞的生長發育、分化及腫瘤的發生、轉移和預后均有關。在卵巢癌中，有學者發現PTEN高表達患者的生存期是低表達者的2.5倍，認為PTEN可作為無病生存期的預測指標。本研究也發現，在Ⅲ期結直腸癌患者中，PTEN基因中表達患者較低表達患者生存時間長。有研究表明，PTEN低表達會增加結直腸癌患者的局部復發風險，并提高腫瘤細胞對放化療的耐受性。另外，本研究結果顯示，CTC與PTEN基因表達情況呈負相關，提示CTC低表達且PTEN高表達患者預后較好。

綜上所述，CTC及PTEN與結直腸癌的發生、發展密切相關，可作為預測結直腸癌患者預后的指標，可以考慮在患者首診時進行常規檢測。另外，本研究病例數有限，結果在一定程度上存在偏倚，需要更大宗的病例以及多中心研究進一步證實。