基于多波長切換HPLC同時(shí)測定荊芥-防風(fēng)藥對(duì)9種化學(xué)成分及指紋圖譜研究

管娜，拜年，劉冰，毛小文

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

荊芥-防風(fēng)是中醫(yī)臨床治療風(fēng)邪所致疾病的常見藥對(duì)，二者常以1∶1 配伍相須為用，并走于上，發(fā)散風(fēng)寒、祛風(fēng)勝濕之力增強(qiáng)，常用于外感風(fēng)寒、發(fā)熱惡寒、頭痛身痛、風(fēng)疹瘙癢等?！侗静萸笳妗吩唬骸扒G芥……不似防風(fēng)氣不輕揚(yáng)，驅(qū)風(fēng)之必入人骨肉也，是以宣散風(fēng)邪，用以防風(fēng)之必兼用荊芥者，以其能入肌膚宣散故耳?！鼻G芥-防風(fēng)藥對(duì)可單獨(dú)成方，如荊防散；也常作為君藥組成復(fù)方，如消風(fēng)散、驅(qū)風(fēng)一字散、防風(fēng)通圣丸等。

藥理研究表明，荊芥和防風(fēng)具有相似的藥理作用，兩者均可抗炎、抗過敏、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、止血、抗驚厥、增強(qiáng)免疫等[1-3]。荊芥、防風(fēng)揮發(fā)油的抗炎作用均優(yōu)于單味藥，表明該藥對(duì)在抗炎效應(yīng)上表現(xiàn)出協(xié)同作用[4]。李曉如等[5]研究發(fā)現(xiàn)，荊芥、防風(fēng)配伍后其揮發(fā)油成分組成及相對(duì)含量均發(fā)生變化，并產(chǎn)生新物質(zhì)。

目前，對(duì)于該藥對(duì)單獨(dú)成方或作為君藥的制劑，其質(zhì)量控制均以荊芥、防風(fēng)成分為主要指標(biāo)，但存在質(zhì)量控制成分單一，成分代表性不強(qiáng)，達(dá)不到整體控制效果等問題。本試驗(yàn)基于多波長切換HPLC 技術(shù)同時(shí)測定荊芥-防風(fēng)藥對(duì)中9 種化學(xué)成分，并建立其指紋圖譜，為該藥對(duì)相關(guān)制劑的綜合質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀（包括G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A 脫氣機(jī)、G1311A 四元泵、Chemstation 色譜工作站、G1315B 可變波長檢測器）。對(duì)照品木犀草苷（批號(hào)CHB201227，純度≥98%）、橙皮苷（批號(hào)CHB201220，純度≥98%）、木犀草素（批號(hào)CHB201228，純度≥98%）、芹菜素（批號(hào)CHB201124，純度≥98%）、升麻素苷（批號(hào)CHB201107，純度≥98%）、升麻素（批號(hào)CHB201106，純度≥98%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)CHB201227，純度≥98%）、印枳樹皮苷（批號(hào)CHB200719，純度≥98%）、亥茅酚苷（批號(hào)CHB201205，純度≥98%），成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠。20 批荊芥、防風(fēng)飲片，購自新疆康達(dá)堂醫(yī)藥有限公司，經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院藥劑科鄭修麗副主任中藥師鑒定，荊芥為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分，防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnibopia divaricata（Turcz.）Schischk 的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

分別精密稱取對(duì)照品木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷適量，混合，加甲醇，搖勻，制成濃度分別為木犀草苷15.1 μg/mL、橙皮苷181.2 μg/mL、木犀草素30.26 μg/mL、芹菜素28.74 μg/mL、升麻素苷173.4 μg/mL、升麻素114.08 μg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷165.29 μg/mL、印枳樹皮苷158.16 μg/mL、亥茅酚苷167.84 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取荊芥、防風(fēng)粉末各1g，精密稱定，混合置于50 mL 具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取30 min，取出，放冷至室溫，過濾，加甲醇適量，洗滌2 次，合并濾液和洗液，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Agilent SB C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-甲醇（1∶1，A）-0.03%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0→19 min，12%→13%A；19→25 min，13%→14%A；25→40 min，14%→25%A；40→53 min，25%→45%A；53→70 min，45%→60%A；70→90 min，60%→80%A），多波長切換檢測（0～61 min 為283 nm，檢測木犀草苷、木犀草素、芹菜素、橙皮苷；61～90 min 為254 nm，檢測升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中與各對(duì)照品對(duì)應(yīng)的色譜峰理論塔板數(shù)均大于3000，9種成分所對(duì)應(yīng)色譜峰的分離度均大于1.5。

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10、20μL，注入色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸[6]，結(jié)果見表1。9種成分在各自線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9997～1.000 0。

表1 9 種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并記錄峰面積，結(jié)果木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷峰面積RSD 分別為0.32%、0.76%、0.75%、1.89%、1.66%、2.24%、1.74%、2.08%、1.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（JF1），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、12、24、48h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得到木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷在48h 內(nèi)峰面積RSD分別為1.73%、0.31%、1.53%、2.06%、2.67%、3.16%、2.83%、2.15%、3.14%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（JF1）6份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算得到木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷含量RSD分別為1.25%、1.38%、1.13%、1.37%、1.23%、2.54%、3.14%、2.24%、2.66%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已測含量的同一批樣品（JF1）9份，每3份為一組，按低、中、高3個(gè)水平精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷的平均加樣回收率分別為100.58%、97.05%、101.55%、98.13%、102.64%、99.26%、97.54%、102.52%、98.71%，RSD分別為1.38%、2.35%、1.54%、2.58%、3.02%、1.96%、3.27%、2.04%、0.86%。9種成分的回收率均符合要求。

2.4 樣品含量測定

取20批樣品（JF1～JF20），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算9 種成分的含量?；旌蠈?duì)照品及供試品HPLC圖譜見圖1，測定結(jié)果見表2。

表2 20批荊芥-防風(fēng)藥對(duì)樣品中9種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

圖1 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)中9 種成分HPLC 圖譜

荊芥-防風(fēng)藥對(duì)中9種成分含量分別為：木犀草苷0.560 5～1.291 6 mg/g，橙皮苷0.926 2～3.114 9 mg/g，木犀草素0.1286～1.4629mg/g，芹菜素0.1305～0.4472mg/g，升麻素苷0.6406～2.100 8mg/g，升麻素0.1811～0.8012mg/g，5-O-甲基維斯阿米醇苷0.3511～2.324 3 mg/g，印枳樹皮苷0.019 6～0.162 2 mg/g，亥茅酚苷0.3373～0.5374 mg/g。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取20批樣品（JF1～JF20），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣記錄色譜圖，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版），以JF1色譜圖為參照，采用平均數(shù)法、時(shí)間窗寬度0.1生成特征圖譜（R），進(jìn)行多點(diǎn)校正和自動(dòng)匹配，計(jì)算20批荊芥-防風(fēng)藥對(duì)指紋圖譜的相似度。20 批樣品HPLC指紋圖譜見圖2特征圖譜（R）見圖3，相似度結(jié)果見表3。

表3 20 批荊芥-防風(fēng)藥對(duì)HPLC 指紋圖譜相似度

圖2 20批荊芥-防風(fēng)藥對(duì)HPLC指紋圖譜

圖3 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)HPLC特征圖譜

20批荊芥-防風(fēng)藥對(duì)與特征圖譜的相似度為0.914～0.972，均大于0.9，表明不同批次樣品的化學(xué)成分具有較好的一致性。指紋圖譜共檢測出24個(gè)共有峰，通過對(duì)照品對(duì)照結(jié)合紫外吸收?qǐng)D，指認(rèn)了木犀草苷（4號(hào)峰）、橙皮苷（7號(hào)峰）、木犀草素（10號(hào)峰）、芹菜素（11號(hào)峰）、升麻素苷（12號(hào)峰）、升麻素（13號(hào)峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（14號(hào)峰）、印枳樹皮苷（15號(hào)峰）、亥茅酚苷（21號(hào)峰）9種成分的色譜峰。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相種類（甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-甲酸水）、甲酸比例（0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.1%）、色譜柱柱溫（25、30、35、40 ℃）、流速（0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min）及進(jìn)樣量（5、10、15、20 μL）進(jìn)行了優(yōu)化，綜合考慮基線情況、色譜峰峰形、分離度、分析時(shí)間等，最終選擇以乙腈-甲醇（1∶1）-0.03%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 m L/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

多波長檢測結(jié)果實(shí)質(zhì)是多個(gè)波長下色譜峰吸收的疊加，通過優(yōu)選色譜峰的最大吸收波長，能夠獲取更多共有峰信息，從而更為準(zhǔn)確、直接地反映樣品的峰信息，但進(jìn)行波長切換時(shí)可能出現(xiàn)基線波動(dòng)。本試驗(yàn)首先以全波長掃描所得吸收峰作為檢測波長，結(jié)合文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，確定木犀草苷、木犀草素、芹菜素、橙皮苷檢測波長在283 nm 附近，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、印枳樹皮苷、亥茅酚苷檢測波長在254 nm 附近，并于61 min 時(shí)進(jìn)行波長切換，使更多色譜峰得到了較好的分離與分析，且未引起明顯的基線波動(dòng)。

對(duì)荊芥-防風(fēng)藥對(duì)進(jìn)行較好的質(zhì)量控制，是相關(guān)制劑質(zhì)量控制的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過多指標(biāo)成分測定及指紋圖譜，建立了荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的質(zhì)量控制方法。在測定成分的選擇方面，盡可能選取荊芥、防風(fēng)的代表性有效成分。研究表明，黃酮類成分是荊芥抗腫瘤[9]、抗氧化及抗炎[10]的主要有效成分，木犀草苷、木犀草素、橙皮苷、芹菜素均為荊芥黃酮的主要成分[8]。防風(fēng)的色原酮類和香豆素類成分是其主要有效成分[11]。升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷等是防風(fēng)中色原酮類代表性成分，印枳樹皮苷是防風(fēng)中香豆素類代表性成分，具有抗氧化、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛及抗血小板聚集等作用[12-13]，與防風(fēng)的功效相符。此外，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷是2020 年版《中華人民共和國藥典》防風(fēng)質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[14]。