芪仙通絡方及其拆方對腦梗死大鼠室管膜下區神經發生及p38MAPK活化的影響

周勝強，李博，王琦，周春吉，劉芳，鄧奕輝

1.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；4.南華大學第一附屬醫院，湖南 衡陽 421001

腦梗死又稱缺血性卒中、中風，具有高發病率、高致殘率、高病死率及高復發率等特點，已成為嚴重威脅我國居民健康的重大疾病之一[1]。對腦梗死后遺留的肢體癱瘓、麻木、失語等神經功能缺損后遺癥，西醫目前仍然缺乏安全、有效的治療措施[2]。長期臨床實踐和觀察表明，中醫治療可顯著改善腦梗死后遺癥，降低其致殘率，提高患者生活質量，有望為腦梗死治療開辟新途徑[3]。

芪仙通絡方系國醫大師劉祖貽教授基于其創新理論“氣陽主用”研制而成的中風效驗方，在補腎活血基礎上加以益氣溫陽，經多年臨床實踐證實，針對中風后神經功能缺損，其療效顯著優于單純補腎活血法。課題組前期通過回顧性研究發現，芪仙通絡方能促進腦梗死患者恢復及后遺癥期腎虛血瘀證患者神經功能，提高其日常活動能力，且未見任何不良反應發生[4]。實驗研究亦表明，本方能顯著促進腦梗死大鼠神經功能恢復，上調缺血腦區腦源性神經營養因子（BDNF）表達，抑制膠質細胞過度活化，促進海馬區神經干細胞再生，但未對室管膜下區內源性神經發生水平及分子調控機制進行探討[5]。因此，本研究旨在通過拆方研究，比較芪仙通絡方及其拆方對腦梗死大鼠神經功能、缺血側室管膜下區神經干細胞增殖、遷移與神經元定向分化及p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化的影響，探討芪仙通絡方補腎活血、益氣溫陽組方配伍的臨床意義及促進神經功能恢復的可能作用機理，從而佐證“氣陽主用”創新理論的臨床指導價值，以期為腦梗死后遺癥的防治提供新的思路與方法。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠80 只，體質量（240±30）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南省中醫藥研究院SPF 級實驗動物中心，溫度（24±0.5）℃，濕度50%，晝夜光照節律，自由攝食飲水，適應性喂養1 周。

1.2 藥物及制備

芪仙通絡方（黃芪30 g，淫羊藿15 g，丹參30 g，枸杞子30 g，制何首烏15 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、補腎活血拆方（枸杞子30 g，制何首烏15 g，丹參30 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、益氣溫陽拆方（黃芪30 g，淫羊藿15 g），飲片購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院，經藥劑科田其學主任藥師鑒定，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》規定。芪仙通絡方水煎后濃縮成原藥材濃度為1.566 g/mL，補腎活血拆方水煎濃縮成原藥材濃度為1.161 g/mL，益氣溫陽拆方水煎濃縮成原藥材濃度為0.405 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。胞磷膽堿鈉膠囊，齊魯制藥有限公司，0.1 g/粒，批號8A0284E20，生理鹽水溶解后稀釋成濃度為0.005 4 g/mL。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），美國Sigma 公司，貨號B5002，用DMSO和生理鹽水稀釋成濃度為20 mg/mL（DMSO 終濃度為1 mmol/L）。

1.3 主要試劑與儀器

p-p38MAPK（Tyr323）抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-23251R；巢蛋白（Nestin）、雙腎上腺皮質激素（DCX）、神經元核抗原（NeuN）、BrdU 抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為GB12137、GB11317、GB11138、GB12051；FITC標記山羊抗小鼠IgG、FITC 標記山羊抗兔IgG、CY3標記驢抗小鼠IgG、HRP 標記山羊抗兔IgG，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為GB22301、GB22303、GB21401、GB23301；DAPI，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1012；免疫組化試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1215。硅膠包被線栓（廣州佳靈生物技術有限公司，規格3600AAA），組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司，型號JJ-12J），石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5），石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），組織攤片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司，型號KD-P），微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司，型號P70D20TL-P4），正置光學顯微鏡（日本尼康，型號NIKON ECLIPSE E100），熒光顯微鏡（日本尼康，型號NIKON ECLIPSE TI-SR）。

2 實驗方法

2.1 造模與評價

參照課題組前期研究方法[5]，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型。造模前12 h 大鼠禁食不禁水，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉；將大鼠仰臥位固定于手術操作臺，取頸部正中切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈；結扎頸總動脈、頸外動脈，動脈夾夾閉頸內動脈，于頸總動脈上端近分叉處（約4 mm）用注射器針頭刺一小孔，將直徑為0.28 mm 的線栓插入頸內動脈，插入深度由分叉處計約18 mm，固定線栓，依次關閉切口。假手術組僅切開皮膚，暴露頸總、頸外、頸內動脈，不予線栓，其余步驟與手術組相同。大鼠清醒后，采用Longa 評分法[6]評定神經功能，評分越高表示神經功能缺損越嚴重。選取1～3 分大鼠納入實驗，死亡大鼠予以隨機替補。

2.2 分組及給藥

將30 只成模大鼠按隨機數字表法分為模型組、芪仙通絡方組（全方組）、補腎活血拆方組（拆方1組）、益氣溫陽拆方組（拆方2 組）和胞磷膽堿組，每組6 只，另設假手術組6 只。于MCAO 術后第3日開始灌胃干預，給藥劑量根據人與大鼠體表面積換算，芪仙通絡方組15.66 g/kg，拆方1 組11.61 g/kg，拆方2 組4.05 g/kg，胞磷膽堿組0.054 g/kg，給藥體積均為2.5 mL，假手術組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日1 次；同時標記BrdU 增殖細胞，參照文獻[7]，大鼠按50 mg/kg腹腔注射BrdU溶液（20 mg/mL），連續12 d。

2.3 取材

大鼠末次灌胃4 h 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，同時夾閉腹主動脈，將注射器針頭經心尖插入主動脈端并固定，生理鹽水灌流，待心臟無血液流出及前爪、肺部顏色變白后，4%多聚甲醛100 mL 灌注，開顱取腦，去除小腦、腦干及嗅球后，將大腦置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存，用于免疫熒光和免疫組化檢測。

2.4 神經功能評分測定

于造模后第3、7、14 日采用改良神經功能缺損評分[6]評定大鼠神經功能，對大鼠運動、感覺、反射和平衡能力進行全面評價，總分18 分，分值越高表示神經功能缺損越嚴重。

2.5 免疫熒光雙標法檢測神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化水平

采用免疫熒光雙標法檢測大鼠缺血側室管膜下區Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數，分別觀察內源性神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化水平。將BrdU 標記的腦組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm 連續冠狀切片；60 ℃烤片2 h，常規脫蠟至水；EDTA（pH＝8.0）抗原修復23 min，2 mol/L 鹽酸37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L 硼酸漂洗10 min，3%BSA 室溫封閉30 min；分別加入BrdU 一抗（1∶100）、Nestin 一抗（1∶100）、DCX 一抗（1∶100）、NeuN 一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜；室溫復溫30 min，PBS 洗5 min×3 次，分別滴加FITC 標記山羊抗小鼠IgG（1∶50）、FITC 標記山羊抗兔IgG（1∶50）、CY3 標記驢抗小鼠IgG（1∶50），室溫避光孵育1 h；PBS 洗5 min×3 次，滴加DAPI 染色液復染細胞核，室溫避光孵育10 min；PBS 洗5 min×3 次，加入抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取5 個缺血側室管膜下區視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算單位面積內Nestin、DCX、NeuN 與BrdU 雙標陽性細胞數，取其平均值進行定量分析。

2.6 免疫組化檢測p-p38MAPK 蛋白表達

采用免疫組化檢測大鼠缺血側室管膜下區p-p38MAPK 蛋白表達。腦組織切片常規脫蠟至水，EDTA（pH＝9.0）抗原修復20 min；3%雙氧水室溫避光孵育25 min，滴加3%BSA，室溫封閉30 min；加入p-p38MAPK（Tyr323）抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜；滴加HRP 標記山羊抗兔IgG（1∶500），室溫孵育50 min，DAB 顯色，蘇木素復染細胞核，脫水后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。以棕黃色顆粒為陽性表達，每張切片隨機選取5 個缺血側室管膜下區視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算p-p38MAPK 蛋白表達的平均光密度（MOD），進行相對定量分析。

3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。實驗數據以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性分析采用Pearson 相關分析法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 芪仙通絡方及其拆方對模型大鼠神經功能評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損癥狀明顯，各時間點神經功能評分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組第7、14 日神經功能評分明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與拆方1 組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組第7、14 日神經功能評分顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠不同時間點神經功能評分比較（，分）

表1 各組大鼠不同時間點神經功能評分比較（，分）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與拆方 1 組比較，☆P＜0.05；與拆方2 組比較，▲P＜0.05；與胞磷膽堿 組比較，△P＜0.05

4.2 芪仙通絡方及其拆方對模型大鼠室管膜下區神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化水平的影響

BrdU 陽性表達細胞核呈紅色熒光，Nestin、DCX、NeuN 陽性表達細胞質呈綠色熒光，細胞核為藍色熒光，Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞核為紅色，胞質為綠色，分別代表神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化水平。假手術組大鼠缺血側室管膜下區可見少量Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞，其中NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數最少；與假手術組比較，模型組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數均有所增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數均明顯增加（P＜0.01）；與拆方1 組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU雙標陽性細胞數增加最明顯（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組大鼠缺血側室管膜下區Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU雙標陽性細胞表達比較（，個/mm2）

表2 各組大鼠缺血側室管膜下區Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU雙標陽性細胞表達比較（，個/mm2）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01；與拆方1 組比較，☆P＜0.05；與拆方2 組比較，▲P＜0.05；與胞磷膽堿組比較，△P＜0.05

圖1 各組大鼠缺血側室管膜下區Nestin、DCX、NeuN、BrdU 陽性表達（免疫熒光染色，×400）

4.3 芪仙通絡方及其拆方對模型大鼠室管膜下區p-p38MAPK 蛋白表達的影響

假手術組大鼠室管膜下區有少量p-p38MAPK 蛋白表達，模型組p-p38MAPK 蛋白表達升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組p-p38MAPK 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與拆方1組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組p-p38MAPK蛋白表達升高最明顯（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠缺血側室管膜下區p-p38MAPK 蛋白表達比較（免疫組化染色，×400，，每組6 只）

4.4 神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化細胞數與神經功能評分和p-p38MAPK 表達的相關性分析

造模后第14 日，采用Pearson 相關分析法分析全方組與模型組大鼠缺血側室管膜下區神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化細胞數與神經功能評分和p-p38MAPK 蛋白表達的相關性。全方組大鼠缺血側室管膜下區Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數與神經功能評分呈顯著負相關（r＝-0.94，P＜0.01；r＝-0.91，P＜0.01；r＝-0.95，P＜0.01），與p-p38MAPK 蛋白表達呈顯著正相關（r＝0.90，P＜0.01；r＝0.90，P＜0.01；r＝0.88，P＜0.01），見圖3。提示芪仙通絡方可能通過促進p38MAPK 磷酸化上調內源性神經發生水平，進而恢復腦梗死大鼠受損神經功能。

圖3 神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化細胞數與神經功能評分、p-p38MAPK 蛋白表達的相關性分析

5 討論

由于溶栓或機械取栓等血管再通療法嚴格的時間窗限制，大部分腦梗死患者會留下不同程度的肢體癱瘓、失語等神經功能損傷后遺癥[8]。西醫采用康復鍛煉、干細胞或外泌體移植、神經營養因子等方法治療，以促進神經重塑或替代病灶丟失的神經元，但存在療效不理想及治療方法尚不成熟的問題[9]。

中醫在促進腦梗死后神經功能恢復方面具有一定優勢[10]。國醫大師劉祖貽教授認為，腎藏精，精生髓，腦髓化生源于腎精。現代醫學中的神經元胞體、突起、髓鞘、突觸等結構均為中醫學“腦髓”的重要組成部分。腦梗死所致功能缺損應歸因于“腦髓虧損”，而“髓”屬陰，促進梗死后神經再生過程即為促進腎精化腦髓的過程，其中腎陽的鼓舞、推動作用非常重要，即《黃帝內經》所謂“陽生陰長”。因此，劉祖貽教授創新性地提出了“氣陽主用”理論[11]。芪仙通絡方系在該理論指導下經多年臨床實踐研制而成的中風效驗方。方中君藥黃芪大補元氣；淫羊藿佐君藥黃芪益氣溫陽，溫補腎中陽氣，配伍制何首烏、枸杞子補腎填精，達助陽生陰之用，共為臣藥；佐以丹參等活血通絡之品。諸藥合用，共奏益氣溫陽、補腎活血之功。目前醫家多采用單純補腎活血法、補腎益氣活血法或補腎活血基礎上加用附子、干姜等藥力峻猛的溫陽藥治療腦梗死[12-15]，而少有在補腎活血基礎上加以柔和的益氣溫陽藥，意在少火生氣者。本研究結果表明，芪仙通絡方及其拆方均可顯著降低腦梗死大鼠神經功能評分，促進其神經功能恢復，其中又以全方組作用最佳，說明“氣陽主用”創新理論及其指導下的補腎活血藥與益氣溫陽藥配伍具有協同增效作用。

腦梗死后神經功能缺損后遺癥產生的根本原因是神經元減少[16]。目前普遍認為，成年哺乳動物室管膜下區、海馬齒狀回等部位存在神經干細胞，但正常情況下處于休眠狀態[17]。而在特定條件如缺血、神經營養因子等因素刺激下，內源性神經發生可以被誘導，室管膜下區神經干細胞激活、增殖并向缺血紋狀體區域遷移，同時分化為神經元并整合入神經環路[18]。如不進行干預，其分化為神經元的概率十分有限[19]。因此，近年來通過提高內源性神經發生水平促進神經功能恢復的治療方法越來越受到關注[20-21]。在神經發生過程中，神經干細胞的增殖、遷移、分化受細胞內MAPK、Wnt、Notch、BMP 等信號通路及細胞外相鄰細胞、細胞因子、激素、神經遞質、細胞外基質等的精準調控[22]。其中作為MAPK 家族重要成員的p38MAPK 信號通路日益受到重視，該通路的關鍵元件p38MAPK 發生磷酸化是該通路激活的標志。既往研究發現，下調p-p38MAPK 表達可顯著抑制體外培養的人海馬神經干細胞增殖，抑制大鼠室管膜下區神經干細胞遷移及向神經元定向分化[23-25]。提示p38MAPK 在神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化過程中扮演關鍵角色。本實驗結果顯示，大鼠腦缺血發生后，缺血側室管膜下區 Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數較假手術組有所增加，同時p-p38MAPK 蛋白表達上調。芪仙通絡方干預后，缺血側室管膜下區Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及 NeuN/BrdU 雙標陽性細胞數及p-p38MAPK 蛋白表達進一步升高，表明芪仙通絡方能促進腦梗死大鼠缺血側室管膜下區神經干細胞增殖、遷移、神經元定向分化及p38MAPK 活化。此外，通過Pearson 相關分析發現，芪仙通絡方干預后，腦梗死大鼠缺血側室管膜下區神經干細胞增殖、遷移及神經元定向分化細胞數與神經功能評分呈高度負相關，而與p-p38MAPK 蛋白表達呈高度正相關，進一步說明p38MAPK 信號通路介導的室管膜下區神經發生可能在芪仙通絡方促進腦梗死大鼠神經功能恢復過程中發揮了重要作用。

綜上所述，芪仙通絡方及其拆方能改善腦梗死大鼠受損神經功能，其機制可能與促進缺血側室管膜下區p38MAPK 活化、上調內源性神經發生水平有關，其中以全方組作用最佳。