自動染色機應用于病理術中快速冷凍切片的效果和價值

吳 穎，陳 娜，郭玉娟，吳坤河，郜紅藝

術中快速冷凍病理切片能幫助外科醫(yī)師決定手術方式和范圍，使患者免受二次手術的痛苦[1]，而切片的染色質(zhì)量直接影響病理診斷的準確性[2]。傳統(tǒng)手工染色步驟操作繁瑣、費時費力且人為因素的影響較大，切片的同時需兼顧染色，易導致染色質(zhì)量不穩(wěn)定[3]。因此，本科室引進一臺NQ100S自動快速冷凍切片染色機，旨在保障冷凍切片的染色質(zhì)量。雖然常規(guī)染色使用全自動染色機早已被廣泛應用[4]，但是使用自動染色機對術中快速冷凍切片進行染色的相關報道相對較少，故本文就其應用效果和價值進行探討。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2019年10月1日～2020年3月31日廣東省婦幼保健院病理科接收的術中冷凍標本500例，每例標本連續(xù)切片2張，淋巴結組織3～4 μm厚切片，乳腺保乳手術切緣組織9～10 μm厚切片，乳腺腫塊、腸管和卵巢腫塊組織5～6 μm厚切片，固定后隨機分為手工染色組和自動染色機組。

1.2 儀器與試劑廣州耐確NQ100S自動快速冷凍切片染色機，Leica CM1950冷凍切片機，OCT冷凍包埋劑，乙酸 ∶95%乙醇 ∶甲醛為5 ∶85 ∶10組成的AAF固定液，80%乙醇，95%乙醇，無水乙醇，成品蘇木精和伊紅，1%鹽酸乙醇，碳酸鋰返藍液，封片劑。當染色效果紅藍對比欠佳，圖像欠鮮艷，提示染液試劑應更換。試劑更換的頻率為蘇木精和伊紅每染200張冷凍切片更換1次，鹽酸乙醇和碳酸鋰溶液每染100張冷凍切片更換1次，乙醇每染50張冷凍切片更換1次。本實驗中的舊試劑定義為使用次數(shù)超過上述標準一半量的試劑。

1.3 方法

1.3.1自動染色機染色 (1)標本冷凍切片貼片后置于AAF固定液中30 s；(2)啟動一鍵式按鈕進行染色，染色程序：水洗10 s→蘇木精100 s→水洗10 s→1%鹽酸乙醇1 s→水洗10 s→飽和碳酸鋰水溶液8 s→水洗10 s→1%伊紅4 s→水洗6 s→80%乙醇5 s→95%乙醇8 s→100%乙醇10 s→100%乙醇10 s；(3)染色機鳴笛提示染色結束，把玻片從出樣缸中取出；(4)干燥后封片送病理醫(yī)師診斷。

1.3.2手工染色 手工染色步驟按照自動染色機程序進行。

1.4 觀察指標

1.4.1染色效果評分 由兩位病理醫(yī)師對切片HE染色進行雙盲法獨立評分，評分標準見表1，滿分10分。鮮艷：細胞核呈藍色，染色質(zhì)呈顆粒狀，胞質(zhì)呈粉紅色至桃紅色，紅藍對比分明；較鮮艷：細胞核呈淡藍色，胞質(zhì)呈淺紅色，紅藍對比欠清晰；不鮮艷：細胞核呈灰藍色，染色質(zhì)模糊，胞質(zhì)呈淺灰紅色，紅藍對比差。

表1 HE染色效果評分標準

1.4.3染色成本 成本主要包括設備成本、試劑成本和人力成本。

2 結果

2.1 手工組和自動染色機組的染色效果評分比較自動染色機組的淋巴結和保乳切緣的染色評分均高于手工組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，染色效果對比見圖1～4。兩組乳腺腫塊、腸管和卵巢腫塊的染色評分差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 不同組織的手工組和自動染色機組染色評分對比

圖1 淋巴結手工染色：染色欠鮮艷 圖2 淋巴結自動染色機染色：染色鮮艷 圖3 保乳切緣染色：染色欠鮮艷 圖4 保乳切緣自動染色機染色：染色鮮艷

2.2 手工組和自動染色機組染色效果穩(wěn)定性的比較手工組中，使用舊試劑、切片質(zhì)量差和室溫≤10 ℃的染色評分分別低于使用新試劑、切片質(zhì)量好和室溫≥25 ℃的染色評分，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。自動染色機組中，使用舊試劑和室溫≤10 ℃的染色評分與使用新試劑和室溫≥25 ℃的染色評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而切片質(zhì)量差的染色評分則低于切片質(zhì)量好的染色評分，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.779，P=0.001，表3)。

表3 不同因素對手工組和自動染色機組染色評分的影響

2.3 手工組和自動染色機組染色時效性的比較接收單例標本制作冷凍切片時，手工組和自動染色機組的染色時間[(615.04±133.40) svs(617.26±165.51) s]差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.074，P=0.941)；同時接收2例標本制作冷凍切片時，自動染色機組的染色時間(986.80±167.60) s低于手工組(1 114.54±165.98) s，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.829，P<0.001)。

2.4 手工組和自動染色機組的成本對比據(jù)統(tǒng)計，本科室平均每年約1 200例術中快速冷凍標本，平均1例需切片約5張，1年合計有冷凍切片6 000張。自動染色機的試劑缸容量為100 mL，手工染色的試劑缸容量為300 mL。根據(jù)各試劑購買價格和更換頻率得出自動染色機的每年試劑支出成本約0.8萬元，手工染色的每年試劑支出成本約2.4萬元。兩組的人工成本相同，每年約12.0萬元。自動染色機購買價為10.0萬元，按10年折舊計算，每年成本約1.0萬元，總計自動染色機每年支出成本為13.8萬元，比手工染色的每年支出成本14.4萬元節(jié)省0.6萬元。

3 討論

本實驗對比自動染色機與手工染色的效果評分后發(fā)現(xiàn)，自動染色機對淋巴結和保乳切緣兩類組織的染色效果評分高于手工組，而兩種染色方式對乳腺腫塊、腸管和卵巢腫塊三類組織的染色效果評分差異無統(tǒng)計學意義，提示保乳切緣和淋巴結等富含脂肪和淋巴成分的組織更適合于使用自動染色機進行染色，一方面可能與這兩類組織切片難度較大有關，這兩類標本都經(jīng)常摻雜較多脂肪組織，若冷凍溫度過低，易使組織變脆后造成切片脆裂，若冷凍溫度不夠又不能使脂肪組織凍硬從而造成切片呈糊狀難以展平[5]；另一方面可能是手工染色時上下提插使染液沖力過大導致易脫片[6]，而自動染色機的機械臂運行緩慢、沖力較小，因此染色效果評分更高。乳腺腫塊、腸管和卵巢腫塊等組織的纖維背景更多，冷凍后稍硬，對染色條件與方式更有兼容性，不易造成染色效果的明顯差異。

本實驗發(fā)現(xiàn)人工染色使用舊試劑時的染色評分比使用新試劑時下降，而自動染色機組的染色評分無明顯變化，可能與人工染色時使用的玻片架體積較大，在浸染切片的過程中會隨著染色批次的增多而損耗更多的染液有關[7]，而自動染色機使用機械夾直接夾持玻片進行染色，不使用玻片架，浸入染液的只有玻片使得試劑還未有太多損耗從而保證較好的染色質(zhì)量。冷凍切片質(zhì)量的好壞直接影響冷凍切片的染色效果，如切片厚薄不均、有裂隙或褶皺、出現(xiàn)冰晶或空洞等均會導致切片不完整或有重疊從而使染色質(zhì)量下降，因此與手工染色組一樣，自動染色機組也在切片質(zhì)量差時染色評分下降。自動染色機有恒溫裝置，染色效果不易受室溫變化的影響，而手工染色則受個人水平不同和經(jīng)驗的影響，一方面難以調(diào)節(jié)染液的溫度，另一方面?zhèn)€人對適當延長染色時間的把握不準，因而染色效果難以穩(wěn)定導致評分下降。

當同一時間段接收2份冷凍標本時，使用自動染色機染色的時間比人工染色更短，這是由于技術員可在自動染色機對上例切片染色時對下一例標本進行切片，使技術員可以將更多的精力放在切片上，不僅提升了制片質(zhì)量又縮短了整個制片時間。另外，每年手工染色比自動染色機的成本多0.6萬元，可能與自動染色機的試劑缸容量較小，是手工染色試劑缸的1/3，以及其機械夾夾持玻片減少帶液量有關，說明自動染色機可一定程度上節(jié)省試劑的損耗與成本。

綜上所述，自動染色機與傳統(tǒng)的手工染色相比，其染色效果更穩(wěn)定，操作簡單方便，可輔助病理技術員提高工作效率，縮短出具病理報告的時間，還節(jié)省了試劑成本，是病理技術室標準化平臺建設的發(fā)展趨勢，可在病理科中推廣使用。