非小細胞肺癌中EGFR、ALK、KRAS基因突變及PD-L1表達的關系

李 潔，伍錦鳳，葉 慶，汪 靜

隨著分子生物學的發展以及基因測序技術的革新，肺癌的治療已經步入基因分子分型靶向精準治療和免疫治療時代。有學者提出非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者基因突變狀態可以反映PD-L1表達水平，且與免疫檢查點抑制劑(ICIs)療效相關。已有報道指出，NSCLC組織中PD-L1的表達模式可以隨著基因突變、癌細胞蛋白表達或腫瘤浸潤免疫細胞數量的變化而發生改變[1-4]。另有研究表明，ALK融合的肺腺癌細胞可通過HIF-1a和(或)STAT3增加PD-L1的表達，為ALK融合型肺腺癌患者免疫治療提供了理論依據[5]。此外，KRAS突變可經MEK/ERK信號通路上調PD-L1的表達，提示活化的KRAS在NSCLC免疫微環境中發揮重要作用[6]。PD-L1可影響肺癌免疫治療中的多條關鍵信號通路，探討PD-L1表達水平與肺癌常見驅動基因突變狀態的相關性，將有助于深入了解影響免疫治療的關鍵因素。本實驗運用二代測序(next generation sequencing, NGS)技術檢測128例NSCLC中與肺癌靶向治療相關的20個基因，并分析其相應的臨床病理學特征，同時結合免疫組化結果分析驅動基因突變狀態與腫瘤細胞PD-L1表達的相關性，以期更加精準地指導肺癌患者制訂靶向和免疫治療方案。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集中國科學技術大學附屬第一醫院2019年9月30日～2020年9月30日收治的肺癌手術切除及活檢NSCLC組織標本128例。所有樣本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后保存，HE染色評估腫瘤細胞含量均>20%。128例樣本中手術大標本74例，支氣管鏡活檢樣本54例。其中男性71例，女性57例。年齡33～89歲，中位年齡63歲。根據WHO(2015)肺腫瘤病理分類：腺癌114例，鱗狀細胞癌11例，其他類型3例。根據2017年國際抗癌聯盟(UICC)第8版肺癌TNM分期標準：Ⅰ期8例，Ⅱ期23例，Ⅲ期35例，Ⅳ期62例。有淋巴結轉移者84例，無淋巴結轉移者44例。初診患者112例，耐藥患者16例。吸煙患者45例，非吸煙患者83例。

1.2 DNA提取、文庫構建及測序使用FFPE核酸提取試劑盒(BGI)提取石蠟組織樣本DNA，主要步驟包括脫蠟、消化、吸附、洗脫等；使用EGFR/KRAS/ALK基因突變聯合檢測試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法，BGI)進行靶向擴增與文庫擴增兩輪PCR，構建DNA文庫；使用MGISEQ-2000測序儀對構建的DNA文庫進行測序實驗，并使用“非小細胞肺癌突變基因分析軟件”(V1，華大生物科技)進行數據分析。

1.3 免疫組化使用Dako 22C3抗體和羅氏免疫組化全自動處理系統進行PD-L1免疫組化染色，由2名經過系統培訓的病理科高年資醫師對染色結果進行評估和復核。每張切片隨機抽取10個高倍視野(200×)，PD-L1表達主要位于細胞膜，對鏡下呈現部分或全部胞膜陽性細胞百分比進行計數評分(TPS)，TPS≥1%判定為陽性。

1.4 統計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計數資料使用例數或率(%)表示，PD-L1蛋白表達及EGFR、KRAS、ALK基因突變狀態與肺腺癌臨床病理特征采用χ2檢驗，并進行Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態與NSCLC臨床病理特征的關系在NSCLC中，EGFR基因突變陽性率為55.47%(71/128)，在女性、腺癌患者中的突變率較高(P<0.05)，無吸煙史患者突變率高于有吸煙史患者(P=0.065)；ALK基因突變陽性率為4.69%(6/128)，均為EML4-ALK融合類型，ALK融合發生的突變率在女性患者中具有高于男性患者的趨勢(P=0.05)，突變陽性患者更易發生胸膜轉移(P=0.031)；KRAS基因突變陽性率為8.59%(11/128)，EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態與患者年齡、TNM分期、淋巴結轉移均無明顯相關性(P>0.05，表1)。

表1 EGFR、ALK、KRAS突變與NSCLC臨床病理特征的關系

2.2 PD-L1表達與NSCLC臨床病理特征的關系PD-L1在肺癌細胞中呈細胞膜染色，染色強度分為陰性、弱陽性、強陽性(圖1)。TPS=0占30.47%(39/128)，TPS 1%～49%占41.41%(53/128)，TPS≥50%占28.12%(36/128)。男性(P=0.073)、非吸煙患者(P=0.022)中PD-L1≥1%水平相對較高；其中肺腺癌(P=0.007)、Ⅲ+Ⅳ期患者PD-L1 TPS 1%～49%水平相對較高(P=0.022)。PD-L1表達與患者年齡、胸膜侵犯、淋巴結轉移無相關性(P>0.05，表2)。

圖1 A.PD-L1陰性肺癌石蠟組織HE染色；B.PD-L1陰性，EnVision法；C.PD-L1弱陽性肺癌石蠟組織HE染色；D.PD-L1弱陽性，EnVision法；E.PD-L1強陽性肺癌石蠟組織HE染色；F.PD-L1強陽性，EnVision法

表2 PD-L1表達與NSCLC臨床病理特征的關系

2.3 NSCLC中PD-L1表達與EGFR、KRAS、ALK突變的相關性KRAS突變患者PD-L1陽性率高(P=0.022)；在EGFR突變患者中PD-L1 TPS 1%～49%水平患者陽性率較高(P=0.025)，但總體陽性率僅具有較高的趨勢(P=0.092)；PD-L1表達與ALK表達無關(P>0.05，表3)。與EGFR突變患者比較，KRAS突變患者腫瘤細胞PD-L1表達水平較高(P=0.028)，而與ALK突變型及野生型組相比差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。EGFR 19del/L858R及KRAS G12D/G12C各突變亞型患者之間PD-L1表達差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。PD-L1表達與KRAS基因突變呈顯著正相關(r=0.203，P=0.022)，與EGFR基因突變呈負相關，但差異無統計學意義(r=-0.149，P=0.093)，與ALK基因突變無相關性(r=0.067，P>0.05，表4)。

表3 PD-L1表達與NSCLC腫瘤分子分型的相關性

表4 NSCLC中PD-L1表達與EGFR、ALK、KRAS基因突變狀態的相關性

圖2 A.EGFR、ALK、KRAS突變型及野生型患者PD-L1表達水平比較；B.EGFR、KRAS突變亞型間患者PD-L1表達水平比較

3 討論

在NSCLC中，EGFR突變可激活與腫瘤發生發展相關的下游信號通路。既往研究表明，EGFR突變與非吸煙女性亞裔肺腺癌患者密切相關[7]。本組中，EGFR突變在女性(P=0.022)、腺癌(P<0.001)中頻率較高，雖然非吸煙患者EGFR突變率高于吸煙者，但與患者吸煙史、年齡、TNM分期無相關性(P>0.05)，可能由于納入研究的樣本量少，具有一定局限性。ALK融合是腫瘤最常見的活化和過表達機制，融合的主要形式是EML4-ALK，發生率占5%～6%[8]。ALK重排多見于年輕、女性、從不或輕度吸煙的晚期肺腺癌患者[9]。本組6例ALK陽性患者融合類型均為EML4-ALK，陽性率為4.69%，與文獻報道一致；融合發生率在女性、年輕、腺癌、晚期患者中較高。KRAS基因突變可促進腫瘤生長，在亞洲肺腺癌患者中約占10%，且在老年、男性、吸煙、肺黏液型腺癌中的陽性率高[10-13]。本組中KRAS突變率為8.59%，與既往研究基本一致；在老年、男性、肺腺癌的患者中陽性率較高，但差異無統計學意義。此類患者預后較差，且與EGFR-TK1耐藥密切相關，因此檢測KRAS突變狀態對NSCLC治療具有重要的指導意義[14]。

PD-1與PD-L1結合可抑制CD4、CD8+T細胞的增殖與活化，促進T細胞凋亡，負性調控機體的免疫應答過程。有研究表明，PD-L1表達水平在女性、非吸煙、腺癌患者中較高，在EGFR、KRAS突變型NSCLC細胞組中高于野生型組，使用EGFR抑制劑可以降低其在突變型組細胞中的表達水平，但對野生型組不產生影響[1,15-16]。本組中PD-L1表達水平在非吸煙患者中高于吸煙者(P=0.022)，在男性患者中表現出高于女性的趨勢(P=0.073)；EGFR(P=0.092)、KRAS突變患者陽性率高(P=0.022)，且在KRAS突變患者中高于EGFR突變患者(P<0.05)，但與ALK突變及野生型患者組間差異無統計學意義。

綜上所述，PD-L1表達與EGFR、KRAS有相關性，其表達水平在肺癌不同突變亞型之間存在差異，以PD-L1為靶點的免疫治療方案有望成為EGFR、KRAS突變型患者的輔助治療手段。