透明細胞性腎細胞癌中MYBL2表達及臨床意義

眭怡群，楊 芹，涂 健，楊天宇，謝佳明，張永勝

透明細胞性腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)起源于腎小管上皮細胞，是腎細胞癌中最常見且預后最差的病理類型。目前對其的治療手段有限，主要以根治性腎切除術為主，但術后易復發和轉移，致死率高。因此，探索ccRCC潛在生物學標志物和治療靶點的研究越來越多[1-2]。骨髓母細胞增生癥病毒癌基因同源物樣2(MYB proto-oncogene like 2, MYBL2)基因又名B-myb，定位于20q13染色體上，與A-myb、C-myb是同源基因，在增殖細胞中廣泛表達。MYBL2參與調節細胞周期、細胞存活和細胞分化等多種生理過程，且其過表達與癌癥的發生密切相關[3]。已有研究表明，在前列腺癌、肝細胞肝癌、肺癌、乳腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、胃癌和結直腸癌[4-11]等多種腫瘤中均存在MYBL2過表達，且MYBL2過表達與肝細胞肝癌、胰腺癌和胃癌患者的不良預后有關[5-7]。目前，關于MYBL2基因在ccRCC中的研究較少。因此，本實驗通過分析MYBL2 mRNA和蛋白在ccRCC中的表達，探討ccRCC中MYBL2表達及臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2009年10月～2019年8月蘇州大學附屬第二醫院存檔的ccRCC手術切除標本217例及其癌旁正常腎組織185例，所有ccRCC標本均經兩名有經驗的病理醫師復閱確診。其中位于左腎109例，右腎108例；男性149例，女性68例；患者年齡21～88歲，中位年齡60歲，四分位數間距16歲；腫瘤直徑<6 cm者167例，≥6 cm者50例。根據WHO/ISUP分級系統分為4級：其中1+2級155例，3+4級62例；按AJCC第七版臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期204例，Ⅲ+Ⅳ期13例；伴淋巴結轉移者3例，無淋巴結轉移者214例；伴脈管侵犯者15例，無脈管侵犯者202例；伴遠處轉移者5例，無遠處轉移者212例。217例中197例獲得隨訪，主要采用門診復查及電話回訪等形式，隨訪截至2021年3月，隨訪時間1～129個月，中位時間為51個月。患者總體生存時間為手術日至末次隨訪或患者死亡時間。另隨機收集蘇州大學附屬第二醫院病理科存檔的新鮮ccRCC組織及其對應癌旁組織標本各20例。所有患者術前均未接受任何輔助治療。

1.2 qRT-PCR取出液氮中保存的ccRCC組織及其對應癌旁組織，加入Trizol裂解液(Sangon Biotech公司)提取總RNA，并利用全波長酶標儀測定其濃度。經反轉錄試劑盒(購自Tiangen公司)逆轉錄為cDNA，然后用SYBRGreen試劑盒(購自Tiangen公司)進行qRT-PCR檢測。MYBL2基因引物序列：上游5′-CTTGAGCGAGTCCAAAGACTG-3′，下游5′-AGTTGGTCAGAAGACTTCCCT-3′。內參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。每組樣品設置3個復孔，按2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。

1.3 組織芯片構建依據HE染色切片選取存檔組織蠟塊，顯微鏡下觀察切片，并選取具有代表性的病變部位。利用組織芯片構建儀制備組織芯片。

1.4 免疫組化和結果判斷免疫組化采用EnVision兩步法，MYBL2兔抗人單克隆抗體(英國Abcam公司)工作濃度為1 ∶100。MYBL2蛋白陽性染色主要定位于細胞核/質。由兩位病理醫師對切片進行雙盲法閱片，每例鏡下隨機采集10個視野。根據染色細胞比例評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；根據細胞染色強度評分：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。將兩項評分結果相乘作為MYBL2蛋白表達最終評分：0～5分為低表達，6～12分為高表達。

1.5 生物信息學方法從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫(https：//cancergenome.nih.gov/)中獲取原發性ccRCC數據集中經RSEM標準化后的RNA-Seq數據和相應的臨床隨訪數據，最終共納入正常腎組織標本72例，ccRCC組織標本534例，比較ccRCC組織及正常腎組織中MYBL2 mRNA的表達情況，并以534例ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達均值作為cut-off值繪制生存曲線。通過計算Pearson相關系數獲得與MYBL2表達顯著相關的基因，且利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對這些基因進行GO分析，并通過氣泡圖展示結果。

1.6 統計學方法所有數據使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，20對新鮮ccRCC組織及癌旁組織中MYBL2 mRNA的表達水平采用配對t檢驗進行分析。MYBL2蛋白表達在正常腎組織和ccRCC組織之間，及在ccRCC臨床病理特征之間的差異性比較用χ2檢驗(或Fisher概率法)。采用Cox回歸模型進行單因素及多因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ccRCC組織和正常腎組織中MYBL2 mRNA表達20對ccRCC組織和癌旁正常腎組織的qRT-PCR結果顯示，MYBL2 mRNA相對表達量在ccRCC組織中為(188.60%±31.67%)，在癌旁正常組織中為(100.00%±17.29%)，差異具有統計學意義(t=-2.532，P=0.020)。

2.2 ccRCC組織和正常腎組織中MYBL2蛋白表達ccRCC腫瘤細胞呈泡巢狀生長，胞質豐富且透明，間質富含毛細血管網(圖1)。MYBL2蛋白表達主要定位于細胞核/質，呈淡黃色至棕褐色顆粒狀或團霧狀(圖2)。217例ccRCC中57例(26.3%)MYBL2蛋白高表達；185例正常腎臟組織中27例(14.6%)MYBL2蛋白高表達。兩組差異具有統計學意義(χ2=8.232，P=0.004，表1)。

表1 ccRCC及癌旁正常腎臟組織中MYBL2蛋白的表達

圖1 正常腎臟組織和ccRCC組織HE染色：A.正常腎臟組織，可見腎小球和腎小管結構；B.ccRCC組織，胞質透亮的腫瘤細胞呈泡巢狀生長 圖2 ccRCC組織及正常腎臟組織中MYBL2蛋白的表達，EnVision兩步法：A.MYBL2蛋白在ccRCC組織中呈陽性；B.MYBL2蛋白在正常腎臟組織中呈陰性

2.3 MYBL2蛋白表達與ccRCC臨床病理特征的關系MYBL2蛋白表達與ccRCC臨床病理特征的相關性分析表明，MYBL2蛋白表達與ccRCC遠處轉移相關(χ2=5.054，P<0.05，表2)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理學分級、淋巴結轉移、脈管癌栓等臨床病理特征無關(P>0.05)。

表2 ccRCC中MYBL2蛋白表達與臨床病理特征的關系

2.4 預后的相關性分析單因素分析結果顯示，患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、淋巴結轉移、遠處轉移、AJCC分期及MYBL2蛋白表達與ccRCC患者預后相關(P<0.05，表3)。多因素分析結果顯示，患者年齡、腫瘤大小及MYBL2蛋白表達是ccRCC獨立的預后因素(P<0.05，表4)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MYBL2蛋白高表達患者的總生存期(overall survival, OS)顯著縮短(P=0.011，圖3)。

圖3 ccRCC組織中MYBL2蛋白表達與患者生存的關系

表3 影響ccRCC患者預后的單因素分析

表4 影響ccRCC患者預后的多因素分析

2.5 TCGA數據庫分析數據庫結果進一步顯示，534例ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達(151.70±245.19)高于正常腎組織(20.84±89.20)，差異具有統計學意義(P<0.001)。MYBL2 mRNA表達與ccRCC患者生存分析表明(圖4)，與MYBL2 mRNA低表達者相比，高表達者的OS顯著縮短(P<0.000 1)。

圖4 TCGA數據庫對ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達的預后分析：以534例ccRCC中MYBL2 mRNA表達均值為cut-off值繪制生存曲線

2.6 與MYBL2表達顯著相關的基因及其GO分析采用相關系數熱圖展示了ccRCC組織中，與MYBL2表達顯著相關的排名前100個基因，包括CDC20、PLK1、KIF20A、CENPA、KIF2C、CCNB1、PK-MYT1、CDCA8、CDCA3、CEP55等基因(圖5)。對這100個基因進行了GO富集分析，包括了分子功能、生物過程和細胞組成，并通過氣泡圖展示結果。ccRCC組織中MYBL2表達主要與ATP酶活性、微管結合、解旋酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性、有絲分裂細胞周期轉變調控、細胞周期中后期轉換等的調控相關聯(圖6)。

圖5 ccRCC組織中MYBL2與100個基因的相關性熱圖：從左到右關聯減弱

圖6 ccRCC組織中相關基因的GO分析：A.生物過程；B.分子功能；C.細胞組成

3 討論

MYBL2作為轉錄因子參與細胞周期調控、細胞增殖與分化、細胞凋亡與自噬等多種生理過程[3,12]。目前認為，MYBL2可通過促進癌細胞增殖、介導化療藥物耐藥性和促進癌細胞轉移擴散等方式，參與癌癥的發生、發展。Parikh等[13]報道MYBL2在許多p53突變型癌癥中過度上調，通過與p53協同作用，促進癌細胞的周期進展和細胞存活。此外，Tao等[14]研究表明，在乳腺癌中敲除MYBL2基因，能上調E-cadherin的表達，而MYBL2過表達則下調E-cadherin表達，且增加間充質標志物的表達，提示MYBL2可能通過上調上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)相關調控因子SNAIL的表達，從而介導EMT的激活和癌細胞的侵襲。

本實驗結果發現，ccRCC組織中MYBL2 mRNA的相對表達量高于癌旁正常腎組織，ccRCC組織中MYBL2蛋白高表達率也顯著高于正常腎組織，提示ccRCC組織中存在MYBL2過表達。MYBL2蛋白表達與臨床病理特征的相關性分析表明，MYBL2蛋白高表達與ccRCC遠處轉移相關，而與其它臨床病理參數無相關性。Sun等[15]利用生物信息學分析表明，MYBL2蛋白高表達與ccRCC患者性別、高組織學分級、臨床晚期、淋巴結轉移及遠處轉移相關。Nientiedt等[16]研究表明MYBL2在高組織學分級、臨床晚期ccRCC患者中高表達。本實驗結果顯示，盡管MYBL2蛋白表達與淋巴結轉移、脈管癌栓及AJCC分期無統計學相關性，但在有淋巴結轉移、有脈管內癌栓及AJCC分期(Ⅲ+Ⅳ期)ccRCC患者中，MYBL2蛋白高表達率有升高的趨勢，分析其可能由于本組病例總體分期較早，有淋巴結轉移及脈管內癌栓者較少，樣本內部參數可能存在一定偏差，故MYBL2蛋白表達與臨床病理特征的相關性可能仍需更多的研究驗證。本組預后分析顯示，MYBL2蛋白表達與ccRCC患者生存時間呈負相關。此外，利用TCGA數據庫進一步證實，與正常腎組織相比，ccRCC中MYBL2 mRNA表達明顯上調，且MYBL2 mRNA的高表達與ccRCC患者的不良預后密切相關。上述研究結果提示，MYBL2過表達可能參與了ccRCC的發生、發展和轉歸。

相關系數熱圖顯示，在ccRCC組織中，MYBL2與CDC20、PLK1、KIF20A等基因明顯相關。已有研究[17-21]表明，上述MYBL2相關基因與細胞周期進展及多種癌癥的發生、發展有關。GO富集分析表明，ccRCC組織中MYBL2相關基因明顯富集在ATP酶活性、微管結合、解旋酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性等分子功能，染色體、著絲粒、紡錘體、微管等細胞組分，進而調控有絲分裂細胞周期的轉換。因此，推測MYBL2基因與其顯著相關基因可能通過上述功能簇，參與ccRCC的發生、發展和轉歸，具體作用機制有待進一步分析。

綜上所述，MYBL2在ccRCC中高表達，其可能成為ccRCC的獨立預后標志物及潛在治療靶點，但其在應用于臨床前仍需進行大量的實驗研究。