早/中孕期孕婦腸道菌群差異及其與妊娠期糖尿病的關(guān)系：前瞻性隊(duì)列研究

王 佩，馬良坤，劉俊濤

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科， 北京 100730

全球妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，我國(guó)GDM發(fā)病率高達(dá)14.8%[2]。GDM可影響母嬰結(jié)局[1,3]，顯著增加母嬰遠(yuǎn)期患代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4- 5]。GDM的發(fā)病與妊娠期胰島素抵抗加重及胰島β細(xì)胞功能障礙相關(guān)，但具體分子機(jī)制尚不明確[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)[7]、肥胖[8]以及免疫性疾病[9]的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且可能參與GDM發(fā)病。目前關(guān)于孕婦腸道菌群和GDM相關(guān)性的報(bào)道較少，且研究對(duì)象多處于中/晚孕期[10- 13]，缺乏早孕期研究證據(jù)。本研究探討早/中孕期女性腸道菌群物種及功能特點(diǎn)，并分析其與GDM的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

1.1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性隊(duì)列研究。研究對(duì)象為2017年5月至12月北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科招募的妊娠期女性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)：孕13+6周前建檔產(chǎn)檢；(2)單胎妊娠；(3)年齡20～45歲；(4)規(guī)律產(chǎn)檢并可按要求進(jìn)行隨訪。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕前或早孕期明確診斷患有任何類型的糖尿病，包括1型糖尿病、T2DM和其他特殊類型糖尿病；(2)患有胃腸道疾病、高血壓、自身免疫性疾病等；(3)孕前接受大型胃腸道手術(shù)者；(4)近3個(gè)月內(nèi)服用抗生素者。

1.1.2 分組

根據(jù)《妊娠合并糖尿病診治指南(2014)》[14]，將妊娠24～28周經(jīng)75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)確診為 GDM 的孕婦納入研究組，無(wú)GDM的孕婦設(shè)為對(duì)照組。

本研究已在clinicaltrails.gov注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)：NCT04420507)，并通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：JS- 1535)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料收集

在研究對(duì)象入組時(shí)進(jìn)行問卷調(diào)查，內(nèi)容包括：年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、本次妊娠情況(孕/產(chǎn)次、預(yù)產(chǎn)期、輔助生殖方式)、既往病史等。

1.2.2 糞便樣本采集

分別于早孕期(9～13+6周)(T1)和中孕期(24～27+6周)(T2)使用可常溫保存的糞便采樣標(biāo)本管(PSP? Spin Stool DNA Kit，德國(guó)Stratec公司)留取糞便標(biāo)本(囑孕婦使用適配的無(wú)菌采樣器取新鮮糞便約1 g浸泡于標(biāo)本管內(nèi)保存液中)，避光室溫保存并于產(chǎn)檢隨訪時(shí)上交，所有標(biāo)本于留取1周內(nèi)進(jìn)行糞便DNA提取[15]。

1.2.3 樣本DNA提取、擴(kuò)增、純化和測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并將提取的DNA用無(wú)菌水稀釋至1 mg/L。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物515F- 806R對(duì)16S rDNA的V4測(cè)序區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR體系：Phusion Master Mix(2×)15 μL，Primer(2 μmol/L)3 μL，gDNA(1 mg/L)10 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至30 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度與載樣緩沖液進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(美國(guó)Illumina公司)建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后使用HiSeq 2500平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果進(jìn)行物種注釋并統(tǒng)計(jì)基于豐度的物種分布情況，然后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理并分析，包括：(1)Alpha多樣性：采用Qiime 1.9.1軟件進(jìn)行分析，以Chao1指數(shù)評(píng)估菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映菌群多樣性；(2)Beta多樣性：采用R 2.15.3軟件的Adonis進(jìn)行分析，以反映組間群落結(jié)構(gòu)的相似性；(3)差異物種鑒別：采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)1.40.0軟件尋找組間相對(duì)豐度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種(設(shè)置LDA score的篩選值為3)；(4)Tax4Fun功能預(yù)測(cè)[16]與差異比較：提取京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組16S rRNA 基因序列并利用BLASTN 算法將其比對(duì)至SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫(kù)建立相關(guān)矩陣，將通過UProC(ultra-fast protein domain classification)注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組功能信息對(duì)應(yīng)至SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中，實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋。所有標(biāo)本的測(cè)序數(shù)據(jù)以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)序列為參考序列聚類出OTUs，進(jìn)而獲取基因功能注釋信息，采用reporter score的差異富集法分析各組包含的KEGG通路的豐度差異，其絕對(duì)值大于1.6(相當(dāng)于正態(tài)分布90% CI)，說明差異顯著。

1.3 樣本量估算

1.4 質(zhì)量控制

本研究由經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)的3名研究員進(jìn)行研究對(duì)象的招募入組、標(biāo)本收集指導(dǎo)和隨訪工作，并留存研究完整記錄。采用常溫糞便采樣標(biāo)本管留取標(biāo)本以避免標(biāo)本提取前變質(zhì)失效，由研究員把控取樣流程，嚴(yán)格遵循采樣和檢驗(yàn)的時(shí)效性要求。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析菌群各指標(biāo)的最佳臨界值。采用多因素Logistic回歸分析腸道菌群Alpha多樣性及菌群相對(duì)豐度與GDM的關(guān)系。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共145例符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的孕婦入選本研究。其中研究組34例、對(duì)照組111例。研究組孕婦年齡及75 g OGTT 0 h、1 h、2 h血糖值均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，孕前BMI、GDM診斷孕周以及經(jīng)產(chǎn)婦比率等與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

表1 兩組孕婦的臨床特征比較

2.2 腸道菌群物種差異及與妊娠期糖尿病的關(guān)系

2.2.1 兩組早/中孕期腸道菌群Alpha多樣性和Beta多樣性比較

Alpha多樣性分析顯示，研究組早孕期腸道菌群的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)低于對(duì)照組(P均<0.05)，Chao1指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)，中孕期時(shí)各指數(shù)與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者早孕期與中孕期組內(nèi)比較，各指數(shù)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采用ROC曲線分析確定早孕期Alpha多樣性各指數(shù)的最佳臨界值(Chao1指數(shù)為1544.13、Shannon指數(shù)為6.51、Simpson指數(shù)為0.96)。多因素Logistic回歸分析在調(diào)整年齡、孕前BMI后顯示，早孕期Shannon指數(shù)≤6.51、Simpson指數(shù)≤0.96是中孕期發(fā)生GDM的危險(xiǎn)因素(表2)。

表2 兩組早孕期腸道菌群Alpha多樣性比較及多因素Logistic回歸分析

Beta多樣性分析結(jié)果顯示，研究組早孕期和中孕期腸道菌群組成結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異(PT1=0.148，PT2=0.498)；組內(nèi)早/中孕期的比較中，對(duì)照組顯示出明顯差異(P=0.01)，而研究組無(wú)顯著差異(P=0.608)。

2.2.2 兩組早/中孕期腸道菌群物種差異分析

早孕期時(shí)，研究組有15個(gè)類群的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，在屬水平上擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)和毛菌屬(Leptotrichia)的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。中孕期時(shí)，研究組有13個(gè)類群的相對(duì)豐度與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。研究組擬桿菌目(Bacteroidales)及其親本分類群擬桿菌門(Bacteroidetes)和擬桿菌綱(Bacteroidia)，以及巨單胞菌屬(Megamonas)及其親本分類群c_Negativicutes和o_Selenomonadales相對(duì)豐度均高于對(duì)照組(P均<0.05)，梭菌目(Clostridiales)及其親本分類群厚壁菌門(Firmicutes)和梭菌綱(Clostridia)的相對(duì)豐度均低于對(duì)照組(P均<0.05)(圖1)。

圖1 兩組腸道菌群物種差異的LEfSe分析

2.2.3 早孕期腸道菌群主要物種相對(duì)豐度與GDM的關(guān)系

由于LEfSe分析顯示，研究組在早孕期腸道菌群多個(gè)類群的相對(duì)豐度明顯低于對(duì)照組，為探索與中孕期發(fā)生GDM相關(guān)的早孕期腸道菌群特征菌屬，采用ROC曲線下面積法計(jì)算早孕期腸道菌群主要物種(在屬水平上相對(duì)豐度排名前35的物種)相對(duì)豐度的最優(yōu)臨界值。以中孕期是否合并GDM為因變量，早孕期腸道菌群主要物種為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，校正年齡、孕前BMI后，早孕期擬普雷沃菌屬相對(duì)豐度≤0.004、毛螺菌屬相對(duì)豐度(Lachnospira)≤0.0107是中孕期發(fā)生GDM的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

表3 早孕期腸道菌群主要物種與GDM關(guān)系的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.2.4 兩組早/中孕期腸道菌群功能差異分析

兩組早孕期腸道菌群功能通路相對(duì)豐度較少存在差異，僅脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)合成和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS)等通路在GDM組富集，而鞭毛裝配和細(xì)菌趨化性通路在對(duì)照組富集。中孕期時(shí)，與能量代謝(氧化磷酸化)、糖代謝(三羧酸循環(huán)、PTS、半乳糖代謝、戊糖-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換)、細(xì)菌生物膜合成(LPS合成、甘油磷脂代謝)、氨基酸代謝和維生素及輔因子代謝(葉酸合成、煙酸及煙堿代謝、核黃素代謝、抗壞血酸代謝)相關(guān)的通路在研究組顯著富集(圖2)。

圖2 兩組腸道菌群功能通路相對(duì)豐度富集分析

3 討論

本研究對(duì)早/中孕期婦女的腸道微生物群落組成和功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GDM患者孕早期時(shí)的腸道菌群物種多樣性Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，且早孕期Shannon指數(shù)≤6.51(OR=3.15,95% CI:1.32～7.52)、Simpson指數(shù)≤0.96(OR=2.54，95% CI:1.09～5.89)、擬普雷沃菌屬相對(duì)豐度≤0.004(OR=2.65, 95% CI:1.09～6.44)、毛螺菌屬相對(duì)豐度≤0.0107(OR=3.17, 95% CI:1.33～7.55)是中孕期發(fā)生GDM的危險(xiǎn)因素。菌群功能預(yù)測(cè)及比較分析發(fā)現(xiàn)，GDM患者在中孕期時(shí)與糖代謝、能量代謝等相關(guān)的通路呈富集狀態(tài)。

腸道豐富的菌群及其結(jié)構(gòu)多樣性有助于宿主維持物質(zhì)和能量代謝等功能的穩(wěn)定及有效抵御致病性微生物的入侵[18]，腸道微生物多樣性降低與肥胖、胰島素抵抗和血脂異常相關(guān)[19]。Alpha多樣性反映樣本內(nèi)群落的豐富度和多樣性，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落的物種多樣性，Chao1指數(shù)反映群落的豐富度。本研究中GDM組早孕期腸道菌群的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，且多因素Logistic分析顯示早孕期Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)降低是GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示早孕期腸道菌群物種多樣性的降低可能與中孕期發(fā)生GDM存在一定關(guān)系，與Ma等[20]針對(duì)早孕期腸道菌群特征與GDM關(guān)系的前瞻性研究結(jié)果一致。本研究中兩組組內(nèi)和組間的比較中，Chao1指數(shù)均未顯示出差異，提示孕婦腸道菌群的群落豐度可能較為穩(wěn)定。

Beta多樣性反映組間群落組成結(jié)構(gòu)的差異。本研究?jī)H在對(duì)照組的早/中孕期比較中Beta多樣性存在顯著差異，提示隨著孕期改變，健康孕婦的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。Koren等[17]比較了91名孕婦早孕期和晚孕期的腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)其Beta多樣性存在顯著差異，且與是否患GDM無(wú)關(guān)。腸道菌群Beta多樣性是否隨孕期進(jìn)展或GDM疾病狀態(tài)變化而發(fā)生改變目前尚不明確，可能與腸道菌群易受飲食結(jié)構(gòu)、人種、地域影響有關(guān)[21]。

孕期腸道微生物的群落組成保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，均以擬桿菌門和厚壁菌門為主，輔以放線菌門和變形菌門[13,17]。本研究LEfSe分析顯示，中孕期時(shí)GDM組擬桿菌門相對(duì)豐度高于健康孕婦，而厚壁菌門相對(duì)豐度低于健康孕婦，此種擬桿菌占比增高而梭菌占比減少的分布特點(diǎn)與T2DM患者腸道菌群的分布相似[19]。多項(xiàng)研究報(bào)道擬桿菌門/厚壁菌門的比值與血糖、胰島素抵抗[22]呈正相關(guān)。GDM孕婦即使在分娩后，其腸道菌群的厚壁菌門相對(duì)豐度仍低于健康對(duì)照孕婦，這可能是GDM孕婦患T2DM風(fēng)險(xiǎn)增加的原因之一[23]。GDM組中孕期時(shí)巨單胞菌屬及其親本分類群的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，與Kuang等[13]針對(duì)中孕期GDM患者腸道菌群進(jìn)行的宏基因組分析結(jié)果一致。針對(duì)冠心病患者的研究發(fā)現(xiàn)，巨單胞菌屬相對(duì)豐度與膽固醇水平呈正相關(guān)[24]，提示巨單胞菌屬可能與宿主的糖脂代謝異常存在一定相關(guān)性。

本研究多因素Logistic回歸分析提示，早孕期擬普雷沃菌屬和毛螺菌屬的相對(duì)豐度降低可能是中孕期發(fā)生GDM的危險(xiǎn)因素。既往有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖或高脂飲食均可使小鼠腸道中的擬普雷沃菌屬豐度降低，而給予益生菌干預(yù)后其豐度可回升[25]。擬普雷沃菌屬在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)的人群腸道中相對(duì)豐度明顯降低，表明擬普雷沃菌屬豐度降低可能與糖脂代謝紊亂有關(guān)，進(jìn)而引起GDM[26]。毛螺菌屬能分泌短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)[27]，在糖尿病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬的相對(duì)豐度與血糖呈負(fù)相關(guān)[28]。食物中不能被直接消化的碳水化合物在腸道會(huì)經(jīng)特殊菌群發(fā)酵，生成包括乙酸、丙酸、丁酸在內(nèi)的多種SCFAs，SCFAs減少可能與胰島素抵抗加重有關(guān)[29]。此外，SCFAs參與維持腸道黏膜屏障的完整性，其分泌減少會(huì)增加腸壁滲透性，減弱腸黏膜屏障功能，使腸道內(nèi)的條件致病菌、LPS等滲透進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身慢性炎癥反應(yīng)，加重胰島素抵抗[30- 31]。本研究對(duì)腸道菌群功能的分析亦發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GDM患者早孕期時(shí)LPS合成相關(guān)通路明顯富集。分泌SCFAs菌的減少以及LPS的增加可能共同加劇了孕婦糖代謝的異常。孕中期時(shí)GDM已經(jīng)發(fā)生，表現(xiàn)為與能量、糖和氨基酸代謝等相關(guān)的多種菌群功能的富集，可能是在高糖環(huán)境下，腸道菌群作出的代償性反應(yīng)，即為適應(yīng)宿主的高糖代謝狀態(tài)，腸道菌群適應(yīng)性地加強(qiáng)了自身對(duì)糖和能量代謝等的處理能力，此種菌群功能的特征性改變可作為GDM的干預(yù)靶點(diǎn)。

目前研究認(rèn)為，腸道菌群紊亂導(dǎo)致的產(chǎn)丁酸菌的減少、LPS增多，是發(fā)生胰島素抵抗和代謝綜合征的原因之一[7,32]。因此，進(jìn)行菌群干預(yù)可能對(duì)GDM的早期預(yù)防有一定效果。利用益生菌、益生元對(duì)GDM進(jìn)行干預(yù)的臨床研究已有報(bào)道。Callaway等[33]應(yīng)用益生菌來對(duì)超重/肥胖女性進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)早孕期補(bǔ)充益生菌能夠預(yù)防GDM的發(fā)生。一項(xiàng)納入11項(xiàng)臨床研究的Meta分析顯示，補(bǔ)充益生菌似乎能改善GDM孕婦的血糖、血脂、炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)[34]。但目前通過腸道菌群干預(yù)來預(yù)防/緩解GDM的研究較少，尚無(wú)確切結(jié)論。

本研究尚有不足之處：(1)由于缺乏孕婦孕期飲食結(jié)構(gòu)和能量攝入的相關(guān)數(shù)據(jù)，飲食結(jié)構(gòu)的個(gè)體化差異可能影響GDM的發(fā)生。(2)本研究樣本量較小，而腸道菌群的個(gè)體差異較大，結(jié)果可能存在偏倚。后續(xù)的研究可借助多種組學(xué)方法優(yōu)化研究設(shè)計(jì)，根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)等影響因素作分層分析，在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確腸道菌群與GDM間的因果關(guān)系，強(qiáng)調(diào)腸道菌群的物種及其功能在GDM發(fā)生發(fā)展中的意義，以期發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于臨床的GDM預(yù)防與治療靶點(diǎn)。

綜上，與健康孕婦相比，中孕期GDM患者腸道菌群的功能特點(diǎn)為L(zhǎng)PS合成、能量代謝、糖代謝和氨基酸代謝相關(guān)通路顯著富集。早孕期腸道菌群物種多樣性降低及某些菌屬的豐度降低是發(fā)生GDM的危險(xiǎn)因素。

作者貢獻(xiàn)：王佩負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、實(shí)施、數(shù)據(jù)采集、統(tǒng)計(jì)分析、撰寫論文；馬良坤指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)；劉俊濤參與研究設(shè)計(jì)和實(shí)施、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持。

利益沖突：無(wú)