高通量測序平臺研究非小細胞肺癌熱點基因突變情況分析

于麗麗

黑龍江省佳木斯市中心醫院檢驗科 154001

肺癌是當今發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已成為多國的嚴重公共衛生問題之一。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)為肺癌的主要類型之一，包括大細胞癌、腺癌、鱗癌等，占肺癌總發病人數的80%左右[1]。肺癌的治療手段比較多樣，包括放療、化療、手術等，但是由于各種因素的影響，很多患者在被確診時已是晚期，失去了手術根治的可能，且生存率一直較低[2-3]。同時目前非小細胞肺癌的診斷方法包括組織細胞檢查、病理活檢、影像學檢查、纖維支氣管鏡檢查等，但都存在一定的不足[4]。隨著醫學技術的發展，基因檢測技術得到了廣泛應用，該技術是通過應用靈敏的基因技術，檢測體液中與疾病發生、發展高度相關的基因突變與表達情況，為疾病的篩查、早期診治與預后評估等方面提供無創性的方法。特別是當前臨床上，居民對于深度測序和高通量測序等大規模測序的需求越來越迫切，高通量測序平臺的應用也比較普遍[5]。高通量測序平臺也稱為第二代測序技術，測序樣本量小，可分析幾十萬條核酸序列，測量效率高[6]。當前有研究發現肺癌患者存在多個基因的突變，這可能也是導致肺癌患者治療效果、臨床特征以及預后生存存在一定差異的原因[7]。本文具體分析了高通量測序平臺研究非小細胞肺癌熱點基因突變情況，以促進非小細胞肺癌的早期檢出。現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年11月—2020年11月在本院腫瘤科診治的非小細胞肺癌患者110例作為肺癌組，同期選擇健康體檢者110例作為對照組。納入標準：本院倫理委員會批準了此次研究；所有入選者均自愿參加實驗，并已簽署知情同意書；年齡20～80歲；具有完整的臨床或體檢資料；肺癌組經組織學和/或細胞學確診為非小細胞肺癌；肺癌組為初治患者，有可測量的病灶；肺癌組采集樣品前沒有進行任何治療；肺癌組預期生存期≥3個月。排除標準：妊娠或哺乳期女性；合并多個部位腫瘤者；伴有嚴重肺纖維化的患者；伴有嚴重內科疾患或嚴重感染者。

兩組入選者的性別、年齡、心率、血壓(收縮壓/舒張壓)、生活行為(吸煙/飲酒)、體重指數等對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。在肺癌組中，病理分型：大細胞癌23例，腺癌47例，鱗癌40例；臨床分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期44例，Ⅲ期30例；組織學分化：低分化44例，中分化34例，高分化32例；淋巴結轉移38例。

表1 兩組一般資料對比

1.2 外周血采集及血漿分離 采集所有患者清晨空腹靜脈血2～3ml，采用EDTA抗凝管收集，靜置于常溫(18～35℃)保存，于2h內分離并凍存血漿。2 000r/min離心5min，取上清血漿組織，在-80℃冰箱保存。

1.3 基因突變檢測 采用QIAamp Mini blood Kit(德國Qiagen公司)提取所有血漿樣本的DNA，嚴格按照說明書進行操作。通過NCBI primer在線引物設計工具進行多重PCR引物設計，利用Illumina高通量測序平臺進行雙端測序，對測得的原始堿基數、原始序列數、堿基質量進行統計，去掉短小序列。建立整個樣本處理后所有序列和去重復后的唯一序列，根據兩組的基因表達水平，利用軟件篩選出顯著差異表達的基因，要求差異倍數≥3，重點分析基因突變主要參與的生化代謝通路和信號轉導通路。采用實時熒光定量PCR驗證KRAS、PIK3CA、TP53基因突變情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.00軟件對本研究所有數據進行分析，計量數據以均數±標準差表示，行t檢驗，計數數據以百分比表示，行χ2檢驗分析，檢驗水準為α=0.05。P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNA質量參數對比 兩組所有入選者DNA提取體積>40μl，濃度>1ng/μl，總量>55ng，<200nt比例<5%，都符合質控要求，兩組對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組DNA質量參數對比

2.2 基因表達中差異 兩組篩選出顯著差異表達的基因共1 245個，其中肺癌組表達上調652個，表達下調593個。

2.3 KRAS、PIK3CA、TP53表達差異情況 基因測序與實時熒光定量PCR顯示肺癌組的KRAS、PIK3CA、TP53表達水平都高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組KRAS、PIK3CA、TP53表達差異情況對比

2.4 KRAS、PIK3CA、TP53基因突變情況對比 基因測序顯示肺癌組的KRAS、PIK3CA、TP53基因突變率分別為30.0%、22.7%、17.3%，高于對照組的3.6%、1.8%和0.9%(P<0.05)。見表4。

表4 兩組KRAS、PIK3CA、TP53基因突變情況對比[n(%)]

3 討論

當前肺癌的發病率一直處于高位，不僅嚴重影響了患者的生命質量，也給國家、社會、家庭帶來沉重經濟負擔。非小細胞肺癌占肺癌的80%以上，約80%以上的患者確診時已是晚期。早期非小細胞肺癌的5年生存率在80%以上，而晚期非小細胞肺癌的5年生存率在20%以上，因此盡早識別肺癌，提高診斷率，是改善患者預后的關鍵[8]。

不過很多非小細胞肺癌患者的臨床表現不特異，影像學檢查顯示為良性結節，而進行病理檢查對患者有一定的創傷性。因此臨床上需要一種操作便捷、檢測準確度高、便于早期診斷、無創、經濟的檢測手段，使非小細胞肺癌的早期檢測能夠方便可行[9]。腫瘤分子標記物檢測具有簡便快捷、創傷小的優勢，已被用于非小細胞肺癌的輔助診斷、病情判斷和預后預測中[10]。特別是隨著高通量測序技術、生物信息學的發展，極大地推動了肺癌分子標記物的發展。本研究顯示兩組所有入選者DNA提取體積>40μl，濃度>1ng/μl，總量>55ng，<200nt比例<5%，都符合質控要求，兩組對比差異無統計學意義(P>0.05)；兩組篩選出顯著差異表達的基因共1 245個，其中肺癌組表達上調652個，表達下調593個。從機制上分析，當前高通量測序平臺所需要的樣本量只需≥10ng即可建庫，而生物信息學可利用數學工具從大量數據中提取有用信息，從而探索非小細胞肺癌患者的發展規律[11]。特別是與Sanger測序法一樣，高通量測序平臺也為一種直接測序法，可發現所分析序列上的所有突變類型，例如微衛星改變、基因突變、異質性缺失、啟動子過甲基化等[12]。當前多數中晚期非小細胞肺癌患者失去了手術的機會，只能采取以鉑類為基礎的化療方案，但其有效率維持在30%左右，中位生存時間不到12個月。與此同時，第二代測序技術的出現，現如今在臨床上已有一些醫院與醫生將高通量測序平臺應用于對腫瘤的研究[13]。本研究的基因測序與實時熒光定量PCR顯示肺癌組的KRAS、PIK3CA、TP53表達水平都高于對照組(P<0.05)；基因測序顯示肺癌組的KRAS、PIK3CA、TP53基因突變率均高于對照組(P<0.05)。從機制上分析，KRAS是原癌基因RAS家族的成員之一，編碼KRAS4a和KRAS4b蛋白，KRAS突變可使得MAPK處于過度活化狀態，促進惡性腫瘤細胞增殖與抑制腫瘤細胞凋亡[14]。PIK3CA是編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇信號通路的重要基因之一，在肺癌發展中起重要作用，可促進細胞增殖、轉移與分化，導致細胞癌變。多數腫瘤組織存在TP53基因的突變，后者可能是腫瘤發生發展的重要危險因素；特別是TP53基因突變使其空間構象發生了改變，使其失去了對細胞增殖、凋亡和DNA修復的調控，有利于腫瘤的增殖[15]。本研究也存在一定的不足，樣本量有限，可能存在一定的抽樣誤差，同時沒有進行多基因突變類型分析，仍有待后續大樣本深入分析。

總之，高通量測序平臺能有效檢出非小細胞肺癌熱點基因突變情況，具有很好的應用可行性，值得推廣應用。