基于TaqMan實時熒光PCR的擬松材線蟲分子鑒定技術

宋志強，張旭君，康李鵬，王立超，周立峰，陳鳳毛

(1.淳安縣林業局，浙江淳安 311799；2.南京林業大學林學院，江蘇南京 210037)

擬松材線蟲Bursaphelenchus mucronatus是松屬Pinus植物的寄生性線蟲，廣泛分布于歐亞大陸[1]。作為松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的姊妹種，兩者之間的親緣關系極為接近，個體形態和生物學特性極為相似，占據著相同的生態位，并擁有相同的媒介昆蟲和寄主類群[2]；兩者能夠雜交，產生可育雜交后代，但后代的繁殖能力相對較弱[3－4]。另外，一些擬松材線蟲的蟲株對松樹也具有較強的致病性[5－7]。因此，擬松材線蟲是公認的松材線蟲病病原鑒定最為主要的干擾物種，如何區分松材線蟲和擬松材線蟲成為限制松材線蟲病病原鑒定準確率的主要因素。

當前，國內外對于松材線蟲病病原鑒定大多采用形態學和分子生物學技術。形態學鑒定主要根據雌性成蟲的尾尖突長短來區分松材線蟲和擬松材線蟲[8－9]，但由于個體之間存在一定的差異，往往導致沒有豐富種類鑒定經驗的檢驗人員難以準確識別[10]。另外，由于取樣量和取樣季節等因素的影響，從松木樣品中分離出來的線蟲數量過少或找不到雌性成蟲等情況時有發生，妨礙了形態學鑒定。隨著生物技術的發展，分子技術已經成為松材線蟲物種鑒定的常用輔助手段之一，但由于松材線蟲和擬松材線蟲的親緣關系十分接近，假陽性現象偶有發生，錯誤地將擬松材線蟲鑒定為松材線蟲。因此，在研究松材線蟲分子檢測與鑒定技術的同時，開發擬松材線蟲分子鑒定技術，構建可疑線蟲雙重檢測的分子鑒定技術體系，對于提高松材線蟲種類鑒定準確性具有十分重要的意義，同時也能夠為擬松材線蟲本身的系統發育等基礎生物學研究奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲 供試的30株擬松材線蟲和10株松材線蟲均由南京林業大學森林保護研究所提供，其寄主和來源詳見表1。將各線蟲株系轉接到長滿灰葡萄孢Botrytis cinerea的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上，25℃條件下培養5～7 d，待灰葡萄孢菌絲被取食殆盡時，采用貝爾曼漏斗法收集線蟲[11]，備用。將收集到的線蟲移至無菌水的平皿中，靜置10 min后，棄上清，卵因為有粘性留在平皿的底部。在顯微鏡下觀察，用移液槍吸取獲得單個卵或單條線蟲。

表1 供試線蟲的寄主及來源Tab.1 Geographic origins and host species of the nematode isolates

1.2 DNA提取 線蟲樣品用無菌水洗滌3～5次后，分別取40 μL(約1 000條)置于Eppendorf管中，加入 40 μL 線蟲裂解液(125 mmol/L KCl，25 mmol/L Tris－HCl，pH 8.3，3.75 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L DTT，1.125%Tween20，0.025% gelatine)，加入 2 μL 蛋白酶 K(200 mg/mL)，混勻，在65℃水浴中保持45 min，后95℃ 15 min；12 000 r/min離心3 min，取上清液；用 Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Nanochip測定 DNA的濃度，－20℃備用。對于單條線蟲及單卵則采用10 μL體系的凍融法提取DNA[12]。

1.3 引物與TaqMan探針設計 從GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載39種線蟲的核糖體DNA ITS。其中，傘滑刃屬Bursaphelenchus 36 種:B.mucronatus，B.xylophilus，B.hellenicus，B.rainulfi，B.thailandae，B.hofmanni，B.abietinus，B.anamurius，B.antoniae，B.arthuri，B.borealis，B.braaschae，B.clavicauda，B.conicaudatus，B.corneolus，B.eggersi，B.eremus，B.fungivorus，B.gerbera，B.hildegardae，B.hylobianum，B.okinawaensis，B.paracorneolus，B.paraparvispicularis，B.parathailandae，B.pinasteri，B.pinophilus，B.platzeri，B.poligraphi，B.seani，B.sexdentati，B.sinensis，B.tusciae，B.vallesianus，B.willibaldi，B.yongensis；長尾滑刃線蟲屬 Seinura 2種:S.lii和S.wuae；滑刃線蟲屬 Aphelenchoides 1種:A.macronucleatus。采用BioEid軟件(V7.2)對供試線蟲的核糖體DNA ITS進行比對，在堿基差異較多的區域利用Primer Premier 5軟件設計擬松材線蟲的引物和TaqMan熒光探針。

1.4 TaqMan探針特異性檢測 驗證擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針的特異性，對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進行TaqMan實時熒光PCR。實時熒光PCR儀為ABI SepOnePlus Real-Time PCR System 7500。 反應總體積為10 μL，Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，引物各0.25 μL，探針 0.5 μL，蒸餾水2.5 μL，DNA 模板1.5 μL。 反應程序為50 ℃ 2 min；隨后95℃ 15 s，35個循環；最后60℃ 20 s。

1.5 引物擴增效率分析 分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實時熒光PCR的擴增效率，將擬松材線蟲DNA進行10倍法梯度稀釋5個濃度梯度后進行 TaqMan實時熒光 PCR，反應體系同1.4，獲得各梯度濃度的循環數值(threshold cycle values，Cq)。根據各梯度濃度及相應的Cq值繪制擴增標準曲線，得到線性方程，并通過斜率法計算出引物的擴增效率(Amplification efficiency，E)[13]。

1.6 探針靈敏度檢測 采用1.2方法所提取的單條線蟲和單個卵的DNA進行TaqMan實時熒光PCR，反應體系同1.4，分析擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物TaqMan實時熒光PCR，檢測擬松材線蟲的靈敏度。

1.7 統計分析 TaqMan實時熒光PCR反應均設有3個技術重復和3個生物學重復，并設有1個陰性對照。擴增效率E＝(10－1/S－1) ×100%，S為擴增標準曲線的斜率。相關系數(R2)通過擴增標準曲線回歸計算獲得[12]。數據統計分析使用Microsoft Excel 2007軟件。

2 結果與分析

2.1 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針設計從GeneBank上下載的39種滑刃屬、傘滑刃屬和長尾滑刃線蟲屬線蟲的核糖體DNA ITS，通過多重序列比對，發現在核糖體DNA ITS2存在較多的差異堿基(表2)。

表2 擬松材線蟲特異性TaqMan實時熒光PCR引物與探針設計Tab.2 Designing of special TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

2.2 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針驗證對30株擬松材線蟲和10株松材線蟲分別進行TaqMan實時熒光PCR結果顯示，擬松材線蟲蟲株均檢測到了Cq值(20.2±0.7)，而松材線蟲蟲株均沒有檢測到Cq值，表明所設計的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有特異性。

2.3 擬松材線蟲特異性引物擴增效率 對擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴增效率曲線(圖1A)線性回歸分析，得到擴增效率方程y＝－3.43x＋20.91(圖1B)，再根據斜率計算出擴增效率E＝96%。擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物的擴增效率為90%～105%，表明該引物能夠穩定地擴增基因序列。

圖1 擬松材線蟲特異性TaqMan實時熒光PCR引物擴增效率分析Fig.1 Amplification efficiency of the TaqMan real-time PCR for B.mucronatus

2.4 擬松材線蟲特異性引物與TaqMan探針靈敏度 所有參與TaqMan實時熒光PCR反應的生物學重復和技術重復均得到了穩定的Cq值(表3)，說明所設計的擬松材線蟲核糖體DNA ITS引物與探針具有較高的靈敏性。

表3 擬松材線蟲TaqMan實時熒光PCR引物與探針靈敏度分析Tab.3 Sensitivity of the TaqMan real-time PCR primers and probe for B.mucronatus

3 結論與討論

松材線蟲病是世界范圍內有歷史記載以來最為嚴重的森林病害，對我國及多個國家的松林帶來巨大破壞，造成極其嚴重的經濟和生態損失。因此，松材線蟲被許多國家列為一級檢疫對象。借助現代分子生物學技術，開發特異性強、靈敏度高的分子檢測和鑒定技術成為近年來松材線蟲快速檢測技術研究的前沿和熱點[14]。然而，由于松材線蟲與擬松材線蟲的親緣關系過于接近，檢測結果可能會出現一定的假陽性，造成鑒定結果不準確。本研究瞄準松材線蟲種類鑒定的主要干擾物種擬松材線蟲，基于TaqMan實時熒光PCR技術開發出一套可用于擬松材線蟲分子鑒定的特異性引物和探針，結合已有的松材線蟲分子檢測與鑒定技術，可以構建起可疑線蟲雙重檢測分子鑒定技術體系，為進一步開發實用有效的檢測新設備奠定基礎，在研究思路上具有一定的創新性。研究結果表明，該技術靈敏度高，可以實現對單條擬松材線蟲甚至單個卵的檢測和鑒定，對排除擬松材線蟲的干擾和提高松材線蟲種類鑒定的準確性具有十分重要的意義。與此同時，本研究結果也能夠為深入開展擬松材線蟲本身的系統發育和進化生物學等基礎理論研究提供堅實的基礎。

隨著分子生物學研究的飛速發展，多種分子技術開始應用于線蟲的檢測和鑒定。張立海和趙立榮等[15－16]以松材線蟲ITS1區域上的特異性引物5′－GATGATGCGATTGGTGACT－3′、擬松材線蟲ITS1區域上的特異性引物5′－TGCGCTGCGTTGAGTCGA－3′為正向引物，以5.8S區域上的松材線蟲和擬松材線蟲的通用引物5′－CAATTCACTGCGTTCTTC－3′為反向引物進行PCR擴增，結果松材線蟲擴增的片段長度329 bp，擬松材線蟲擴增的片段長度206 bp，而其他滑刃線蟲與真滑刃線蟲則無擴增產物。陳鳳毛等[17]應用隨機擴增多態性DNA標記(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術篩選出OPC18、OPN18引物組合，在擬松材線蟲株系中擴增出一條970 bp特異性片段，能準確地鑒定擬松材線蟲。Urek等[18]認為限制性內切酶片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)可用于區分多種滑刃屬線蟲和傘滑刃屬線蟲；但陳鳳毛等[19]認為RFLP會產生大量長度相近的酶切片段，導致這種技術不適合大量樣品的快速檢測和鑒定；而Filipiak等[20－21]進一步證實基于實時熒光PCR技術可以用于區分松材線蟲與擬松材線蟲。另外，小亞基(Small subunit，SSU)[22]、大亞基(D2/D3 domain of large subunit，D2/D3 LSU)[23]和線粒體COI基因(Mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI)[24]等均可被用于線蟲的種類鑒定。本研究基于實時熒光PCR技術，針對線蟲遺傳多變區核糖體DNA ITS設計擬松材線蟲特異性的引物和TaqMan探針組合，該組合經驗證具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短等優點，能夠為林業和海關檢疫提供有力的技術支撐。