廣南縣杉木三種侵染性病害病原鑒定

韓雨庭，唐婕，尼瑪此姆，馬煥成，伍建榕，

(1.云南省高校森林災害預警控制重點實驗室，西南林業大學生物多樣性保護學院，云南昆明 650224；2.西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室，西南林業大學林學院，云南昆明 650224)

杉木Cunninghamia lanceolata是松柏目杉科杉木屬的一種重要的用材樹種[1]。杉木屬于常綠針葉喬木，因其生長速度快、主干通直、材質輕柔細膩、木材便于加工等特點，在家具生產、船只建造和建筑等領域被廣泛應用[2－3]。杉木是云南省文山州廣南縣重要的鄉土樹種之一，從20世紀70年代末開始被廣泛種植[4]。隨著廣南縣多措并舉開展實施林業工程項目，杉木已成為面積最大的用材樹種[5]。近幾十年，隨著杉木人工林面積的急劇擴大，加之在同一林地上大面積集中連片栽種等，杉木人工林的弱點逐漸顯露，多種病害不時發生，猖獗危害[6]。

2019年廣南縣杉木幼林出現大范圍的黃化、枯死現象，對當地的經濟造成了巨大影響。據調查，廣南縣3個人工杉木幼林病害癥狀均為針葉褪綠和枯死，病斑上可見大小不一的圓形或梭形小黑點，且病害輕重不一，可能為侵染性病害。為摸清杉木主要的侵染性病害種類和發病情況，減少侵染性病害對杉木生長和材積的危害，筆者對杉木人工林的侵染性病害發生情況進行調查，同時對病原菌進行分離鑒定及致病性測定，以期為病害防治和培育抗病品種等工作提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 感病和健康杉木枝條采自廣南縣珠街鎮小魚溝村、竜達寨子和曙光鄉革洛村小組的杉木人工林。供試試劑Ezup柱式真菌基因組DNA抽提式試劑盒、引物ITS1和 ITS4均為生工生物公程(上海)股份有限公司生產。培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基。

1.2 病原菌分離 選取感病的杉木針葉，采用常規的組織分離法[7]對病原菌進行分離。將純化好的菌株接種于PDA斜面試管中，于4℃保存菌種。

1.3 病原菌形態鑒定 將獲得的代表性純化菌株移接至PDA培養基上25℃培養，觀察并記錄菌落的形狀、色澤、生長速度等，在顯微鏡下觀察并記錄分生孢子的類型、形狀和大小等。選擇癥狀明顯的針葉材料，對病部用徒手切片法[8]切取針葉橫切片，在顯微鏡下觀察病原形態。

1.4 致病性測定 將純化后的病原真菌(KS－10、TJ－2)在 PDA平板上25℃培養7 d，用無菌水沖洗，配制成濃度為106個/mL的孢子懸浮液。采用針刺接種法[9]，每個處理選取5段健康無病斑的杉木小枝，在每個小枝上選取10個針葉進行接種。采用噴霧法將配制好的孢子懸浮液接種在健康杉木的針葉上，設2種病原菌單獨接種、先接種KS－10再接種TJ－2、先接種TJ－2再接種KS－10，共4個接種病原菌處理，對照處理用無菌水代替孢子懸浮液。待接種針葉上產生病斑后，對病斑進行病原菌再分離和鑒定，完成柯赫氏法則驗證。

1.5 病原菌分子生物學鑒定 將純化后的單個菌落作為真菌 DNA提取的材料。利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒對代表菌株的DNA進行提取。采用真菌通用引物 ITS1/ITS4對上述DNA提取物進行PCR擴增[10]，PCR產物送至昆明碩擎生物科技有限公司進行測序。所得序列分別在GenBank數據庫中的 BLAST程序 (www http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)與庫中序列進行比對，下載同源性較高的序列。通過 MEGA 6.0中的最大似然法(Maximum Likelihood，ML)進行系統發育進化樹的構建。

1.6 病害發病程度調查 在廣南縣的杉木林中隨機選取150株，對3種侵染性病害進行調查。依據表1中杉木侵染性病害的分級標準，計算發病率和病情指數。

表1 廣南縣杉木侵染性病害分級標準Tab.1 Disease grading standard of Chinese fir infectious diseases in Guangnan county

發病率(%)＝發病株數/調查總株數×100

病情指數＝∑(各級病株數×該病級值)/(調查總株數×最高級值)×100

2 結果與分析

2.1 杉木炭疽病

菌落特征 分離物KS－10在PDA培養基上，菌落初期圓形，氣生菌絲白色，棉花狀，反面淺橘黃色；生長后期，以菌落中心為圓心，有淺橘色和黑色滲出物，為分生孢子液滴(圖1A)。

形態特征 該病原菌分生孢子盤散生，暫未發現剛毛；分生孢子梗光滑，無色，1～2個細胞(圖1B)；分生孢子透明，無隔膜，直，圓柱狀，兩端鈍圓，大小為(15.2～18.7)μm × (4.4～5.8)μm(圖1C)。

圖1 暹羅刺盤孢的菌落和分生孢子Fig.1 Colony and conidia of Colletotrichum siamense

分子生物學鑒定 構建菌株KS－10的分子系統樹，如圖2所示。菌株 KS－10與參考菌株C.siamense(KP703372、 KP703373、 KP703390、LC208833、LC260488、LC260489、LC420017)位于同一分支，節點自展值為89，與其他近緣種保持較遠的親緣距離。

圖2 基于ITS基因采用最大似然法構建的杉木炭疽病病原菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir anthracnose by maximum likelihood method

鑒定結果 結合形態學特征和分子生物學鑒定，確定杉木炭疽病的致病菌為暹羅刺盤孢C.siamense，屬于炭疽菌屬Colletotrichum，是子囊菌門Ascomycota糞殼菌綱Sordariomycetes小叢殼科Glomerellaceae小叢殼屬Glomerella的無性態。這是國內外C.siamense在杉木上的首次報道。

致病性 接種病原菌KS－10孢子懸浮液5 d后，健康杉木的針葉出現黑褐色壞死斑(圖3A)，而對照組無明顯變化，未出現感病癥狀(圖3B)。對發病組織進行病原物的再次分離，獲得的病原菌與接種的病原菌株KS－10相同，完成了柯赫氏法則的驗證，證明菌株KS－10是杉木炭疽病的致病菌。

廣南縣杉木炭疽病梢枯型與葉枯型混雜，大面積發生。梢枯型多為梢頭10 cm以內的嫩梢莖葉發病，病斑沒有明顯的界限，嚴重時整個針葉紅褐色枯死。葉枯型多從針葉頂尖開始發病，產生較小壞死病斑，初期可見病健交界處明顯呈暗褐色，后期針葉枯死，呈灰白色(圖3C)。

圖3 暹羅刺盤孢對杉木的致病性Fig.3 Pathogenicity of Colletotrichum siamense to Chinese fir

2.2 杉木赤枯病

菌落特征 分離物TJ－2在PDA培養基上，菌落初期圓形，邊緣平滑；氣生菌絲白色絮狀，生長速度快；反面淺橘色；生長后期，有散生的黑色墨汁狀滲出物，為分生孢子盤(圖4A)。

形態特征 該病原菌的分生孢子盤為深棕褐色；分生孢子梗光滑無色(圖4B)。分生孢子5個細胞，(18.4～30.0)μm ×(5.0～6.2)μm；中間 3個有色胞同為橄欖色，上2個有色胞顏色深，第3個顏色較淺；頂孢無色，具2～3根附屬絲，長度為14.5～21.5 μm；基部無色胞錐形，具1根柄(圖4C)。

圖4 小孢擬盤多毛孢菌落和分生孢子Fig.4 Colony and conidia of Pestalotiopsis microspora

分子生物學鑒定 以盤色串孢屬Seiridium cardinale(AF409995、AF377298)為外群，構建菌株TJ－2的分子系統樹(圖5)。菌株TJ－2與參考菌株Pestalotiopsis microspora(KT372347、 GQ855796、KY366172、MK064589、MK064588、JN314418)位于同一分支，節點自展值為87，與其他近緣種區分開來。

圖5 基于ITS基因采用最大似然法構建的杉木赤枯病病原菌的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir copper blight by maximum likelihood method

鑒定結果 依據形態特征和分子生物學鑒定，確定杉木赤枯病致病菌為小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora，屬于半知菌類 Deuteromycotina腔孢綱Coelomycetes黑盤孢目Melanconiales擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis。

致病性 接種病原菌TJ－2的孢子懸浮液5 d后，健康杉木針葉接種點周圍出現褐色壞死斑點(圖6A)，對照組無明顯癥狀(圖6B)。對發病組織進行病原物的再次分離，獲到的病原菌與接種的病原菌株TJ－2相同，完成了柯赫氏法則的驗證，證明菌株TJ－2是杉木赤枯病的致病菌。

杉木赤枯病在廣南縣杉木林中與其他病害間雜發生。病菌在枝梢幼嫩的針葉上侵染，初期為褐色小點，后逐漸擴大形成圓形或不規則暗褐色病斑，病健交界處通常有赤棕色略隆起的交界線。發病后期針葉由深紅褐色變灰白色，病斑上有微凸起的黑褐色子實體產生，最后導致針葉枯死(圖6C)。

圖6 小孢擬盤多毛孢對杉木的致病性Fig.6 Pathogenicity of Pestalotiopsis microspora to Chinese fir

2.3 杉木落針病

形態特征 子囊盤黑色，成熟時中央有條縱裂縫(圖7A，B)；子囊棍棒狀，略有短柄，內含8個子囊孢子(圖 7C，D)；子囊孢子單孢，無色，線形，(45.0～80.0)μm ×(2.0～2.5)μm，在子囊內束狀排列(圖7E)；側絲線性，頂端彎曲。

鑒定結果 通過病原菌形態特征的比對，與李本國 等[11]、邊銀丙 等[12]、魏景超[13]所描述的一致。因暫未有人從杉木上成功分離到杉木落針病的病原菌，本研究中也未成功分離到該病原菌，無法進行分子鑒定，根據前人的形態研究將廣南縣杉木落針病的病原暫定為子囊菌門Ascomycotina錘舌菌綱Leotiomycetes斑痣盤菌目Rhytismatales的杉葉散斑殼Lophodermium uncinatum Dark.。

杉木落針病在廣南縣的杉木上普遍發生。受害針葉初期褪綠變黃，隨著病斑的擴展，針葉上形成黃紅色斑塊，最后整葉枯死。在枯死針葉上產生長橢圓形的黑色子實體，為病原菌的子囊盤(圖7F)。

圖7 杉葉散斑殼及其在杉木上的癥狀Fig.7 Lophodermium uncinatum and its symptoms on the Chinese fir

2.4 暹羅刺盤孢和小孢擬盤多毛孢的復合侵染將純化后的2種病原菌 C.siamense(KS－10)和P.microspora(TJ－2)分別先后針刺接種5～7 d后，與一種病原菌單獨接種相比，復合侵染的病斑明顯增大，顏色明顯加深(圖8)，說明病原菌的復合侵染比單獨侵染病害發生更嚴重。先接種KS－10再接種TJ－2的發病癥狀比先接種TJ－2后再接種KS－10的病斑明顯增大(圖8)，說明KS－10菌株的侵染性比TJ－2的侵染性強。接種后的癥狀表現為初期變為灰綠色，進而為黃褐色斑，最終變為赤褐色而干枯，病葉保濕后產生黑色霉點，與自然發病癥狀相同。發病組織經再分離后均獲得原接種菌，其菌落形態、分生孢子及大小均與原接種菌KS－10和TJ－2真菌一致，而無菌水接種的葉片均未發病，符合柯赫氏法則。

圖8 暹羅刺盤孢和小孢擬盤多毛孢復合侵染癥狀Fig.8 Symptoms of complex infection after inoculation with C.siamense(KS－10)and P.microspora(TJ－2)

在病原菌分離過程中發現，從同一病枝上同時分離到C.siamense和P.microspora的概率比單獨分離到其中一種病原菌的概率大2倍。致病性測定發現，兩個菌種復合接種侵染比單獨接種發病快、發病重，且先接種C.siamense比先接種P.microspora的杉木針葉病斑擴展速度快。結果表明，C.siamense和P.microspora復合侵染可以加重杉木病情，且C.siamense的致病力更強。

2.5 三種侵染性病害發病程度 病害發病程度調查統計結果顯示，廣南縣杉木3種侵染性病害的發病率為91.33%，病情指數為52.33。該縣杉木侵染性病害發生范圍廣且病情嚴重。

3 結論與討論

國內外已有一些關于杉木病害的研究報道，其中杉木黃化病、杉木炭疽病(Glomerella cingulata)、杉木縮頂病(Pestalotiopsis guepinii)、杉木落針病(Lophodermium uncinatum)、杉木細菌性葉枯病(Pseudomonas cunninghamiae)、杉苗猝倒病(Fusarium spp.、Pythium spp.、Rhizoctonia solani)等多種杉木病害猖獗為害，造成了巨大的經濟損失[14－18]。但關于幾種病原菌復合侵染的調查未見報道。

本研究中，通過室外調查、室內試驗和致病性測定發現廣南縣杉木林中杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落針病發生普遍，引起3種杉木侵染性病害的病原菌依次為暹羅刺盤孢Colletotrichum siamense、小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora和杉葉散斑殼Lophodermium uncinatum。

暹羅刺盤孢C.siamense在熱帶、亞熱帶廣泛分布，寄主繁多，侵染植株后可引起炭疽病[19]。自Prihastuti等[20]首次在咖啡豆上發現暹羅刺盤孢后，國內外報道不少植物都受到該病原菌的危害[21－22]，但沒有關于該病原菌危害杉木的相關報道。目前，已有多次報道膠孢炭疽菌C.gloeosporioides可引起杉木炭疽病[14，18，23]，經查閱國內外的文獻資料，未找到C.siamense引起杉木炭疽病的報道。筆者通過形態學觀察、致病性測定，結合分子生物學鑒定，最終確定引起廣南縣杉木炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢C.siamense。這是世界范圍內C.siamense引起杉木炭疽病的首次報道。

復合侵染試驗結果顯示，C.siamense和P.microspora復合侵染時病斑擴展速度大于兩者單獨接種，并且先接種 C.siamense比后接種C.siamense病斑擴展速度更快。廖旺嬌 等[24]研究發現A和B混合接種病斑擴展速度不大于兩者單獨接種，這與本文研究結果相反，可能與侵入先后有關。韓曉勇等[25]研究發現C.siamense對紫山藥有很強的致病力，這與本研究的結論相一致，說明暹羅炭疽菌是引起杉木病害的主要病原菌。

在本次調查研究中，廣南縣杉木3種侵染性病害的發病率為91.33%，病情指數為52.33。該縣杉木侵染性病害廣泛發生，且病情嚴重。病害調查時發現杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落針病常常在同一株杉木上發生，并且病組織切片時發現C.siamense、P.microspora 和C.gloeosporioides經?；旌铣霈F在杉木的枯死針葉上。3種侵染性病害常常復合侵染，使得杉木病害嚴重發生，導致杉木生長停滯，針葉枝條大部分枯死，甚至整株枯死，很大程度上影響了杉木的正常生長和成材。

廣南縣杉木林地情況復雜，病害多樣且嚴重，應多種防治措施并舉。在杉木種植管理過程中，應適地適樹[26]，加強撫育管理的同時做好病害預防[27]；及時除草除灌木，深翻松土，施加氮磷鉀肥[28]。對已發生的病害及時清理病株及殘體，做好病害防治管理，防止病害的進一步擴散[29]。在發病杉木林中，挑選抗病植株進行培育，篩選優良的抗病良種[30]。