輸血對早產兒喂養不耐受及腸道菌群的影響*

曾超，吳迪，丘文，周宏偉，沈薇

(1. 南方醫科大學南方醫院新生兒科，廣州 510515； 2. 南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，廣州 510282)

喂養不耐受(feeding intolerance，FI)，指新生兒腸內喂養后出現嘔吐、腹脹、胃潴留、血便等臨床表現，在早產兒中具有較高的發病率(25%～53%)[1-3]。該疾病與特定新生兒胃腸道不成熟或腸道功能障礙密切相關[4]，常是壞死性小腸結腸炎或敗血癥等嚴重疾病的早期臨床表現[4-5]。對于胎齡<34周的非晚期早產兒，輸血是生命早期較為常見的醫療干預措施[5]。有研究報道，輸血可能是FI的獨立危險因素[6]，尤其是進行紅細胞輸注可引發缺氧腸組織再灌注損傷[7]，進而增加壞死性小腸結腸炎風險[8-10]。近年來，腸道菌群紊亂在壞死性小腸結腸炎中的角色日益受到關注[11]，而輸血可否通過改變腸道菌群影響FI，進而對壞死性小腸結腸炎發揮作用未見報道。本研究回顧性分析輸血對FI事件的潛在影響，初步探索輸血治療的早產兒出現腸道FI表型與腸道菌群內環境間潛在關聯。

1 對象和方法

1.1研究對象 以2021年3月至2021年6月南方醫科大學南方醫院新生兒科重癥監護室(NICU)住院收治的早產兒為研究對象。納入標準：(1)胎齡<34周或出生體重<2 000 g；(2)出生后即轉入新生兒科病房，存活>7 d；(3)獲家屬知情同意。排除標準：(1)合并有多發畸形、遺傳代謝性疾病，伴有血流動力學改變的動脈導管未閉或其他紫紺型心臟病；(2)存在需要外科干預的疾病；(3)存在先天性免疫缺陷性疾病，或母親合并免疫性疾病；(4)生后1周內進行過輸血治療或輸注過血液制品；(5)出院或因其他疾病轉院時尚未達足量喂養等出院標準者。根據生后第1周后是否輸注紅細胞，分為輸血組和對照組。本研究通過南方醫科大學南方醫院倫理委員會審查并獲批準(NFEC-2021-054)。

1.2資料收集 采用回顧性分析。觀察至生后4周或出院時間。依據患兒病情，遵循科室臨床診療規范，統一確定紅細胞輸血量、輸血標準及輸血持續時間。早產兒均為配方奶喂養，喂養間隔時間3 h。輸血前1～2 h及輸血期間奶量減半，輸血結束后喂養量恢復干預前體積。調查輸血組在輸血起始干預后2周內以及對照組在對應周齡段是否發生FI及其臨床特征(包括腹脹、嘔吐、暫停喂養等癥狀次數)。并采集兩組達全胃腸內喂養時間、住院時長等資料。FI診斷標準依據中國醫師協會新生兒科醫師分會循證專業委員會指定的《早產兒喂養不耐受臨床診療指南(2020)》，具體為：胃殘余量超過前一次喂養量的50%，伴有嘔吐和/或腹脹；或喂養計劃失敗，包括減少、延遲或中斷腸內喂養[12]。

收集患兒性別、出生體重、胎齡，出生時是否有窒息缺氧，生后第1周是否合并急性呼吸窘迫綜合征和感染性疾病等一般資料。其中感染性疾病特指細菌感染，包括：羊膜腔內感染、早發型新生兒敗血癥(包含臨床敗血癥)、化膿性腦膜炎、肺炎等，與新生兒窒息及新生兒呼吸窘迫綜合征均參照人民衛生出版社第5版《實用新生兒學》診斷標準[13]。

1.3標本采集 采集輸血組輸血后的第1周、第2周2次糞便樣本，如期間多次輸血則以第1次輸血為準。該時間節點對應于對照組生后第3周至第4周出生周齡，采集對照樣本。所有樣本采集時均使用一次性糞便采樣管，收集尿布上非表層糞便0.5 g，置入無菌凍存管，迅速保存于-80 ℃待測。

1.4主要儀器與試劑 Nano Drop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，VII7000實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Illumina iSeq 100(美國Illumina公司)；QIAamp Mini Kit(德國Qiagen公司)， PCR檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，Phix溶液(美國Illumina公司)，分析純異丙醇、無水乙醇和氯仿(廣東光華化學廠)。

1.5方法

1.5.1DNA提取 -80 ℃保存的糞便樣本，置于4 ℃融解后，采用細菌基因組DNA提取試劑盒QIAamp Mini Kit，參照試劑盒說明書，提取糞便菌群總DNA。用Nano Drop 2000超微量分光光度計檢測DNA濃度及純度，DNA產物保存于-20 ℃備用。

1.5.2PCR擴增 以16S rRNA V4區作為擴增靶標，選用V4可變區的上游引物 514F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物805R：5′-CCGGACTACNVGGTWTCTAAT-3′，對糞便總DNA進行PCR擴增。上述引物插入序列不同的條碼序列以區分樣本。擴增體系20 μL，包括：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，514F 0.4 μL，805R 0.4 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR循環條件為：94 ℃ 2 min；90 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,30個循環；72 ℃ 5 min；5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.5.316S rRNA測序 根據樣本定量PCR擴增曲線中的最高值G，計算各個樣本所需混樣量，同一批次PCR樣本均勻混樣后純化，以Phix溶液將混樣稀釋成50 pmol/L濃度的DNA溶液，取20 μL用于上機測序。開啟Illumina iSeq 100平臺，點擊GenerateFASTQ2.0.0.9模式進行建庫，選擇Nextera XT工具，設計雙末端堿基測序長度為161，命名測序項目，然后點擊Sequence按平臺默認程序測序。測序結束后查看測序數據質量，確認Phix數據占有量接近30%，去掉重復克隆簇后的測序量/總測序量(ClusterPF%)大于75%。

1.5.4生物信息學分析 使用DADA2(版本1.6.0)對每個糞便樣本的16S rRNA測序讀數進行去噪以生成擴增子序列變體(amplicon sequence variants，ASV)。通過PyNAST算法比對代表性序列并通過FastTree構建系統發育樹。基于Greengene(版本13.8)數據庫，使用RDP分類器的默認參數對ASV進行物種注釋。來自試劑對照的ASV被排除在下游分析之外。所有后續的生物統計分析均使用QIIME(版本1.9.1)軟件或R語言(版本4.0.5)進行。根據ASV的注釋結果，分別在各個分類水平統計各樣本的物種相對豐度，繪制菌群堆疊圖、柱狀圖展示菌群構成；同時分析ASV的分類比對結果，比較在輸血組和對照組中觀察到的ASV，以Y表示輸血組，N表示對照組，對兩組的菌群數據分別進行α多樣性分析及β多樣性相異矩陣分析。通過主成分分析(principal component analysis，PCA)圖對兩組數據的相似性進行可視化，用于顯示基于β多樣性相異矩陣和排列多元方差分析(PERMANOVA)的樣本之間的差異，進行999次置換來估計分組β多樣性的統計顯著性。

2 結果

2.1入組患兒基礎資料 本研究共納入早產兒33例，其中生后第1周后進行過紅細胞輸注早產兒共14例，為輸血組；同期無輸血史早產兒19例，為對照組。兩組早產兒的性別、胎齡、出生體重以及基礎疾病等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，組間具有可比性。見表1。

表1 兩組患兒一般臨床資料比較

2.2FI事件比較 輸血組中12例發生FI事件(85.7%)，相關FI癥狀數為(7.7±5.4)次/人；對照組出現7例FI(36.8%)，其相關癥狀數為(6.7±5.9)次/人。兩組早產兒FI事件發生率差異有統計學意義(P=0.005)，但兩組FI患兒間癥狀頻次差異無統計學意義(P=0.712)。見表2。兩組達到全胃腸內喂養所需的時間、住院時長及住院花費間差異均無統計學意義。本研究兩組患兒觀察至4周齡，均未發生壞死性小腸結腸炎。

表2 兩組發生喂養不耐受(FI)事件的比較

2.3腸道菌群比較 研究共獲得來源于33例早產兒的糞便樣本55份。測序并經質控后，共獲得610 515條序列，有效序列為10 758(7 416，13 060)條/樣本。經DADA2去噪后得到1 476個ASV，歸一化到3 180條序列后，保留55個樣本和1 379個ASV進行下游分析。根據細菌門水平(Phylum)分類展示，該階段早產兒輸血組與對照組總體構成相似(圖1)，其腸道菌群以厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，并存在一定比例的放線菌門(Actinobacteria)及擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌。在非輸血組，還觀察到少數個體腸道以浮霉菌門(Verrucomicrobia)為優勢豐度菌。

注：Y，輸血組；N，對照組。

依據ASV水平的菌群多樣性分析，四類α多樣性指數，無論是Chao1(反應物種總數)、observed otu(物種豐富度指數)、PD_whole_tree(系統發育多樣性指數)、Shannon(香農指數，同時反映物種豐富度及均勻度)，兩組間差異均無統計學意義，見圖2A-D。在β多樣性分析中，依據Bray-Curtis距離(基于ASV的計數統計比較兩個群落微生物的組成差異)的PCA，輸血干預組與對照組呈區分趨勢，但P值為0.089，見圖2E。

注：Y，輸血組；N，對照組；A,Chao1;B，observed_otus;C，PD_whole_tree;D，Shannon;E,PCA。

在屬水平，發現兩組間的特定菌豐度差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。輸血組葡萄球菌屬(Staphylococcus)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)顯著高于對照組；而腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)及阿克曼氏菌(Akkermansia)則顯著下降。

3 討論

本研究結果發現，經歷輸血事件早產兒治療結束后2周內，FI發生率顯著高于對照組。盡管樣本量較小，但本研究中對照組FI發生率與文獻報道一致[1-3]，提示本研究結果相對可靠。既往研究主要關注輸血干預與新生兒壞死性小腸結腸炎發生率間關聯，但二者間是否存在顯著關聯，系統評價結果并不一致[6-7,10,14]。從FI發展為新生兒壞死性小腸結腸炎，存在復雜的外界環境(包括喂養、機械通氣、藥物等)及個體病理進程(缺氧、感染等)多因素影響[15]。本研究結果提示，以FI為首要終點事件，將更有利于揭示輸血事件與不良腸道事件間的潛在關聯，從而為未來的臨床干預提供新線索。

盡管兩組間FI發生率存在顯著差異，但兩組間發生FI事件患兒的臨床表現并無差別，且兩組最終達到全胃腸內喂養時間及住院時長差異均無統計學意義。該結果提示輸血事件并未導致更嚴重的FI，且對于病情的恢復及整體治療影響較小。其中一項潛在的原因是，本研究單位輸血治療時常規采取奶量減半喂養保護策略，可能減小了輸血對腸道的干擾。另外，本研究中部分早產兒由于住院時間不足4周而只留取到1份樣本，可能使結果產生一定的偏倚；同時，發生FI患兒均未發生壞死性小腸結腸炎，存在一定的幸存者偏倚。

注：Y，輸血組；N，對照組；Abundance,豐度。

本研究發現，輸血組葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬相對豐度增加，雙歧桿菌屬及腸球菌屬相對豐度減少。雙歧桿菌是健康嬰兒腸道主要優勢菌，對腸道和宿主的發育具有重要作用[11]；健康早產兒腸球菌的相對豐度顯著高于FI早產兒[16]；葡萄球菌、寡養單胞菌與壞死性小腸結腸炎、敗血癥發病高度相關[17]。絕大多數早產兒均接受多種抗菌藥物治療，對腸道菌群整體產生顯著影響。因此，輸血組與對照組間α及β多樣性差異均不顯著。但兩組間差異菌與既往報道的FI及壞死性小腸結腸炎存在關聯，提示腸道菌群在上述疾病中可能具有潛在的因果作用，其具體機制值得深入探討。

本研究不足之處在于樣本量偏小，未能對是否紅細胞輸注、輸血量、輸血次數等進行進一步的亞組分析，無法為腸損傷機制研究提供線索。從菌群角度，進一步擴大樣本量，將有助于探明輸血是否可以改變腸道菌群β多樣性，并為探明特定腸道菌作為FI乃至壞死性小腸結腸炎風險預測新型標志物提供可能。