兒童不典型抗中性粒細胞胞漿抗體陽性情況分析*

戴錦程，張宇航，曹彤，張峰，高嶺

(1.南京醫科大學附屬兒童醫院檢驗科，南京 210008；2.皖南醫學院醫學檢驗系，安徽蕪湖 241002)

抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一種以中性粒細胞和單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體。ANCA是血管炎診斷的重要血清學標志物，主要存在于ANCA相關性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)患者中。兒童AAV罕見，主要以顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)以及肉芽腫型多血管炎(granulomatosis with polyangiitis，GPA)亞型為主，腎臟受累較成人更嚴重[1]。準確的ANCA檢測對AAV診斷、治療和預后判斷具有重要意義[2]。通過間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)檢測可以將ANCA分為核周型抗中性粒細胞胞漿抗體(perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibody，pANCA)、胞質型抗中性粒細胞胞漿抗體(cytoplasmic antineutrophil cytoplasmic antibody，cANCA)和不典型抗中性粒細胞胞漿抗體(atypical antineutrophil cytoplasmic antibody，aANCA)3種類型。據報道，aANCA還出現在炎性腸病[3]、其他自身免疫病(autoimmune disease, AID)及感染的患者中。但目前國內外缺少兒童aANCA陽性病例的報道。本研究就aANCA在兒科疾病中的陽性率及其在兒童AID中的相關臨床意義進行回顧性分析。

1 材料與方法

1.1研究對象 回顧性統計分析南京兒童醫院2019年1月—2020年12月住院和門診共10 638例患者的ANCA檢測結果和臨床資料。各種疾病均有明確臨床診斷，其中血管炎診斷符合Chapel Hill會議對于血管炎的分類標準[4]；過敏性紫癜診斷符合《諸福棠實用兒科學》診斷標準；混合結締組織病、幼年特發性關節炎、SLE的診斷符合美國風濕病協會診斷標準。

1.2儀器與試劑 EUPOStarⅢPlus熒光顯微鏡、Sprinter XL全自動間接免疫熒光操作/酶聯免疫一體機(德國歐蒙公司)，STAR酶免分析系統及FAME全自動酶免分析儀(瑞士澳斯邦公司)；ANCA IIF法檢測試劑(德國歐蒙公司)，髓過氧化物酶(myelope roxidase, MPO)和蛋白水解酶3(proteaseproteinase3, PR3)ELISA檢測試劑(德國AESKU公司)。

1.3方法

1.3.1ANCA檢測 用IIF法檢測ANCA，以HEp-2細胞、乙醇固定的中性粒細胞和甲醛固定的中性粒細胞為抗原基質，對血清樣本進行1∶10稀釋，按試劑說明書進行操作。同時分別設置陰、陽性對照用于判斷實驗的有效性，并進行cANCA、pANCA的陽性、弱陽性、陰性質控。ANCA的判讀標準根據中國醫師協會風濕免疫科醫師分會自身抗體檢測專業委員會的《抗中性粒細胞胞漿抗體檢測的臨床應用專家共識》[5]推薦，必報熒光模型：cANCA、pANCA，選報熒光模式：aANCA。不典型cANCA鑒別要點:在乙醇固定的中性粒細胞上呈現胞漿中均勻彌散分布的細顆粒狀熒光，在核葉間無增強的熒光染色;甲醛固定的中性粒細胞呈現上述一致的熒光染色或陰性。不典型pANCA鑒別要點：乙醇固定的中性粒細胞呈現核周胞漿的平滑絲帶狀熒光，無帶狀熒光向細胞核內浸潤，熒光陽性均勻分布于核周，無不規則的塊狀(需排除ANA核膜型干擾)；甲醛固定中性粒細胞呈陰性，或者在甲醛固定的中性粒細胞上呈現胞漿中淡染、均勻彌散分布的細顆粒狀熒光，在核葉間無增強的熒光染色。

1.3.2ANCA靶抗原檢測 采用ELISA法檢測MPO和PR3，按試劑說明書進行操作，結果大于18 U/mL為陽性。

1.4統計學分析 用SPSS 24.0和EXCLE軟件進行統計學分析。計數資料分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兒童aANCA檢出情況 在10 638例患兒中，ANCA陽性率為4.20%(447/10 638)，其中aANCA陽性率2.86%(304/10 638)，pANCA陽性患兒0.96%(102/10 638)，cANCA陽性患兒0.38%(41/10 638)。在304例aANCA患兒中，包括男性89例，女性215例。

2.2aANCA的靶抗原分布 304例aANCA陽性患兒靶抗原主要以非MPO/PR3為主[占97.04%(295/304)]，MPO陽性6例(占1.97%)，PR3陽性3例(占0.99%)。

2.3ANCA陽性患兒的疾病分布 447例ANCA陽性患兒中，AID患兒121例，aANCA陽性率為73.55%；非AID患兒326例，aANCA陽性最高為65.95%；確診為AAV有14例，其中pANCA 7例，cANCA 2例，aANCA 5例，4例在pANCA治療過程或后續隨訪中轉變為aANCA，此時MPO由陽性轉為陰性。見表1。

表1 447例ANCA陽性患者疾病分布[n(%)]

2.4aANCA陽性患兒在不同疾病中的分布 在304例aANCA抗體陽性患兒中，其中AID患兒為89例(29.28%)，以SLE(38例)、幼年特發性關節炎(19例)、IgA腎炎(6例)為主；非AID患兒為215例(70.72%)，以過敏性紫癜患兒(119例)aANCA陽性率最高，為39.14%；其次為肺炎、支氣管炎18例，中樞神經系統疾病12例，腎炎、腎病綜合征10例。見表2。

表2 aANCA陽性患兒在不同疾病中的分布

3 討論

本研究回顧性分析了10 638例ANCA常規檢測患兒，ANCA陽性447例，占4.20%，與國內相關報道結果一致[6]。aANCA陽性率2.86%高于pANCA、cANCA，這與兒童AAV罕見以及ANCA同時存在于其他疾病中有關。

本研究中AAV有14例，其中pANCA 7例，cANCA 2例， aANCA 5例，4例在pANCA治療過程或后續隨訪中轉變為aANCA，此時MPO由陽性轉為陰性。這一研究提示在臨床檢驗工作中既要規范合理應用ANCA檢測，同時也要注重結合臨床癥狀、病情活動以及治療效果治療。

304例aANCA陽性患兒靶抗原以非MPO/PR3為主，占97.04%。用IIF法測得ANCA陽性時，cANCA或pANCA所對應的靶抗原可能不止一種，比如cANCA對應的靶抗原可能是PR3或者通透性增強蛋白；pANCA對應的靶抗原可能是MPO、乳鐵蛋白、彈性蛋白酶或組織蛋白酶等，而在一些非血管炎的疾病中尚可發現一些非MPO/PR3靶抗原的aANCA。另一方面，ANCA陰性也不能排除小血管炎，要考慮到檢測方法的敏感性、疾病活動性、治療以及病因等因素[7]。

aANCA抗體陽性患兒中，89例AID患兒中含SLE 38例、幼年特發性關節炎19例、IgA腎炎6例，多為ANCA繼發血管炎。有研究表明，ANCA陽性與腎病有一定的關系[6]。腎臟是原發性小血管炎受累的主要部位，其主要表現為狼瘡腎炎、慢性腎炎、慢性腎功能不全及急性腎小球腎炎等疾病。在215例非AID患兒中，過敏性紫癜患兒119例，aANCA陽性率最高。過敏性紫癜是一種兒童常見的血管炎性疾病,以皮膚對稱性可觸性紫癜為主要表現，腎損害是較為嚴重的并發癥，aANCA陽性對并發癥有提示作用。在呼吸道、中樞神經系統、腎臟、心臟、肝臟、皮膚等各系統疾病均有aANCA檢出，這與ANCA主要累及小血管，可累及全身多個器官系統有關，其中腎臟和肺最易受累[8]。

隨著ANCA檢測技術的發展、熒光模型判斷的規范、報告結果的應用，越來越多的靶抗原被發現，ANCA以及aANCA與臨床相關疾病的發生、發展以及預后的關系被不斷研究。在兒童ANCA檢測中，應重視aANCA的規范化檢測、靶抗原確認以及臨床合理應用，為兒童AID的診斷、治療以及預后判斷提供更好的服務。