耐碳青霉烯類抗菌藥物革蘭陰性桿菌臨床分布及耐藥基因調查*

鄒鳳梅，吳玲，李可可，劉剛，魏勤，李軍春，王欣，楊永清，王曉寧

(甘肅省人民醫院檢驗中心，蘭州 730000)

革蘭陰性桿菌是醫院內感染常見的病原菌，也是臨床標本中分離率較高的細菌之一。碳青霉烯類抗菌藥物是一類抗菌譜廣、抗菌活性強的β-內酰胺類抗菌藥物，是臨床治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的首選藥物。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，甚至不合理使用或濫用，耐碳青霉烯類抗菌藥物的革蘭陰性桿菌(carbapenem resistant organism, CRO)逐年增多，給抗感染治療和院內感染控制帶來極大的挑戰。細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制有：外膜孔蛋白減少或丟失伴高水平β-內酰胺酶的持續產生、碳青霉烯酶的產生、藥物作用靶位的改變以及青霉素結合蛋白的改變。碳青霉烯酶按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B和D三類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，以KPC型為主；B類為金屬β-內酰胺酶，以 NDM、IMP和VIM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶[1]。本研究收集2018—2020年臨床標本中分離的60株CRO，對其臨床分布、耐藥機制以及檢測方法進行調查，為CRO抗感染治療合理選藥以及院內感染控制提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年7月—2020年12月臨床送檢標本中對亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一或均耐藥的CRO菌株60株，剔除重復菌株。其中，肺炎克雷伯菌20株、陰溝腸桿菌13株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、弗勞地枸櫞酸桿菌2株和銅綠假單胞菌9株。質控菌株為ATCC 25922大腸埃希菌和ATCC 27853銅綠假單胞菌，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 飛行質譜儀(布魯克公司)，PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(BD公司)，GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測儀(美國賽沛公司)；亞胺培南、美羅培南和厄他培南等藥敏紙片(英國Oxoid公司)；血瓊脂平板、M-H平板(鄭州安圖生物公司)；頭孢他啶/阿維巴坦藥敏紙片、3-氨基苯硼酸(APB)和EDTA試劑(上海抗生素研究所饋贈)；碳青霉烯酶耐藥基因檢測(實時熒光PCR法)試劑盒(美國賽沛公司)。

1.3細菌鑒定及藥敏試驗 用飛行質譜儀進行細菌鑒定。60株CRO菌株中，2株用K-B紙片擴散法、58株用PhoenixTM-100革蘭陰性桿菌藥敏板進行藥敏試驗。參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2020年版文件判斷結果[2]，用儀器專家系統進行結果判定和分析修正。

1.4碳青霉烯酶表型篩選

1.4.1改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)聯合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM) CLSI推薦mCIM聯合eCIM用于腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的檢測。mCIM和eCIM試驗按照2020年CLSI M100文件要求進行操作。

1.4.2碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗是根據A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸(APB)抑制[3]，而金屬β-內酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特點[4-5]，APB聯合EDTA可對單產A類絲氨酸碳青霉烯酶、單產B類金屬β-內酰胺酶以及同時產生A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶的腸桿菌目細菌進行檢測并區分[6]。實驗步驟：將待測菌調制成0.5麥氏濁度單位的菌懸液，均勻涂布于M-H瓊脂平板上，隨后貼4張亞胺培南紙片于瓊脂表面。1張紙片不加任何液體，1張紙片滴加APB溶液(濃度為30 mg/L)10 μL，1張紙片滴加EDTA溶液(濃度0.1 mol/L)10 μL，最后1張同時滴加APB溶液和EDTA溶液。過夜溫育后量取紙片抑菌圈直徑。結果判讀如下：(1)添加APB溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產A類碳青霉烯酶；(2)添加EDTA溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產生B類金屬β-內酰胺酶；(3)如僅同時添加APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，可判斷該受試菌株同時產A類碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶。

1.5實時熒光PCR法檢測碳青霉烯酶基因型 用GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測儀，按照碳青霉烯酶耐藥基因檢測試劑盒說明書檢測5種基因型(KPC、IMP1、NDM、VIM和OXA-48)。

1.6統計學分析 采用WHONET 5.6軟件。

2 結果

2.1菌種分布 60株CRO菌株包括碳青霉烯類耐藥的腸桿菌目細菌(CRE)51株(85.0%)和銅綠假單胞菌9株(15.0%)。其中，CRE包括肺炎克雷伯菌20株(39.22%)、陰溝腸桿菌13株(25.49%)、大腸埃希菌11株(21.57%)、雷極普羅威登菌5株(9.80%)、弗勞地枸櫞酸桿菌2株(3.92%)。

2.2科室分布 60株CRO菌株中，59株(98.33%)分離自住院患者，1株(1.67%)分離自骨科門診患者。住院患者分離菌株來自ICU 20株(33.33%)、神經外科9株(15.00%)、泌尿科9株(15.00%)、燒傷科8株(13.33%)、普外科4株(6.67%)、腦血管外科3株(5.00%)、骨科2株(3.33%)和其他科室3株(5.00%)。

2.3標本來源 60株CRO菌株分離自痰液20株(33.33%)、尿液14株(23.33%)、傷口分泌物11株(18.33%)、血液7株(11.67%)、穿刺液3株(5.00%)、靜脈導管2株(3.33%)和引流液2株(3.33%)。

2.4碳青霉烯酶表型篩選結果

2.4.1mCIM聯合eCIM檢測結果 產絲氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)，產金屬β-內酰胺酶39株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、銅綠假單胞菌6株、肺炎克雷伯菌4株和弗勞地枸櫞酸桿菌1株)，4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性。

2.4.2碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結果 產A類絲氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)；產B類金屬β-內酰胺酶38株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、銅綠假單胞菌6株和肺炎克雷伯菌4株)；混合型(產A+B類酶)1株(弗勞地枸櫞酸桿菌)；4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性。

2.5碳青霉烯酶基因型檢測結果 NDM型32株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、肺炎克雷伯菌4株)；KPC型17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)；IMP1型6株，均為銅綠假單胞菌；KPC+NDM混合型1株，為弗勞地枸櫞酸桿菌；4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)未檢出碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌以產A類絲氨酸碳青霉烯酶，攜帶KPC型基因為主，占80%(16/20)；產B類金屬酶,攜帶NDM基因占20%(4/20)；陰溝腸桿菌、大腸埃希菌和雷極普羅威登菌均為產B類金屬β-內酰胺酶,攜帶NDM基因為主，占92.31%(12/13)和100%(11/11，5/5)。

2.6表型篩選和GeneXpert熒光PCR方法結果的比較 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測結果與PCR方法的檢測結果完全相符，陽性和陰性的符合率均為100%。mCIM聯合eCIM檢測結果與碳青霉烯酶抑制劑增強試驗、PCR方法的陰性符合率為100%，僅將1株產2種碳青霉烯酶的弗勞地枸櫞酸桿菌檢測為單產金屬酶。

2.7抗菌藥物耐藥性 CRO菌株對臨床常用抗菌藥物中青霉素類、頭孢菌素類和β-內酰胺酶抑制劑復合藥(阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦)呈現100%耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮類和復方磺胺甲噁唑抗菌藥物呈現較低敏感性，對替加環素和新型β-內酰胺酶抑制劑復合藥即頭孢他啶/阿維巴坦抗菌藥物呈現較高的敏感性。見表1。

表1 CRO菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥率(%)

3 討論

本研究結果提示，ICU、神經外科、泌尿科和燒傷科的患者是CRO感染的高危人群，對這些科室的患者要做好隔離與防護,醫務人員要做好手衛生以及環境的清潔與消毒，嚴防此類菌株在醫院和患者之間傳播。

采用表型篩選和GeneXpert熒光PCR方法對60株CRO菌株檢測結果的比較，mCIM聯合eCIM檢測結果將1株產2種碳青霉烯酶的弗勞地枸櫞酸桿菌檢測為僅產金屬酶。碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測結果與PCR方法的檢測結果完全相符，陽性和陰性的符合率均為100%。由此可見，mCIM聯合eCIM試驗和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗雖然需時較長(要溫育24～28 h)，但操作簡便、成本低、無需特殊設備，敏感性和特異性較高，是各級臨床微生物實驗室常規開展碳青霉烯酶檢測的有效表型檢測方法。但mCIM聯合eCIM試驗只能準確檢測單一酶，不能準確檢測混合酶。而GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測方法雖操作簡單、需時較短(約1 h出結果)、能準確檢出CRO攜帶碳青霉烯酶的基因型，但需要特殊儀器與試劑，成本高，臨床微生物實驗室常規開展還不現實。

我院CRO菌株的產碳青霉烯酶情況分析顯示，其中肺炎克雷伯菌是以產A類絲氨酸碳青霉烯酶、攜帶KPC型基因為主，產B類金屬酶、攜帶NDM基因為輔，陰溝腸桿菌、大腸埃希菌和雷極普羅威登菌均為產B類金屬β-內酰胺酶、攜帶NDM基因為主，與Zhang等[7]研究結果一致。銅綠假單胞菌主要產B類金屬酶,攜帶IMP1基因為主，占62.5%，與國內多家醫院報道的結果基本一致[8-10]。另有4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性結果，很有可能是細菌外膜蛋白的缺失或數量減少并伴有高表達的AmpC酶、超廣譜β-內酰胺酶的產生，有待進一步研究。

結果顯示，我院CRO菌株對臨床常用抗菌藥物中青霉素類、頭孢菌素類和β-內酰胺酶抑制劑復合藥呈現100%耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮類和復方磺胺甲噁唑抗菌藥物敏感性較小，對替加環素和新型β-內酰胺酶抑制劑復合藥即頭孢他啶/阿維巴坦抗菌藥物呈現較高的敏感性。調查發現，產A類絲氨酸碳青霉烯酶攜帶KPC型基因的細菌對頭孢他啶/阿維巴坦這種新型加酶抑制復合藥均敏感；產B類金屬酶的細菌對頭孢他啶/阿維巴坦這種新型加酶抑制復合藥均耐藥，與文獻報道內容完全一致[1]。故實驗室及時開展CR0耐藥機制的檢測，并在微生物檢驗結果的報告單中提示CR0的耐藥機制，對臨床合理使用抗菌藥物十分重要。