哌拉西林他唑巴坦對類鼻疽伯克霍爾德菌的體外抗菌活性評估*

黃梅會，吳華，周曉君，王旭明

(海南省人民醫院 海南醫學院附屬海南醫院檢驗科，海口 570311)

類鼻疽病是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)所致的人畜共患病。該病主要分布于南北緯20°之間的熱帶和亞熱帶地區，如東南亞和澳洲北部地區[1]。海南島是我國南部最大的熱帶島嶼，與泰國、越南、老撾等類鼻疽病高發國家臨近，其高溫潮濕的熱帶季風氣候使海南島成為B.pseudomallei的主要疫源地。類鼻疽病的臨床表現復雜多變，有“似百樣病”之稱。由于該菌能在吞噬細胞內存活，故引起的慢性感染癥狀與結核分枝桿菌感染相似，當細菌入血時，可形成菌血癥以及內臟膿腫。根據國際治療指南[2]，強化階段靜脈注射頭孢他啶或美羅培南至少2周(危重病人需進行長期強化治療)，根除階段口服抗菌藥物(首選藥物復方磺胺甲噁唑，其次是阿莫西林克拉維酸或強力霉素)至少3個月。然而，最近有來自世界不同類鼻疽病流行國家(包括鄰國印度)的B.pseudomallei對頭孢他啶、復方磺胺甲噁唑和阿莫西林克拉維酸耐藥的報道[3-4]。哌拉西林他唑巴坦抗菌譜廣，注射后組織滲透力強，體液血藥濃度分布高的特點，目前臨床應用廣泛，但鮮見用于B.pseudomallei感染的治療。其主要原因是目前美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)還沒有評估該抗菌藥物對B.pseudomallei的敏感性，體外藥敏報告上沒有該抗菌藥物的藥敏結果，無法選其進行治療。另外，經驗性治療又缺乏臨床數據的總結。本研究通過對109例住院患者類鼻疽病治療過程進行回顧，發現2例患者使用哌拉西林他唑巴坦治療獲得成功，引發我們對其體外抗B.pseudomallei活性的關注。目前國內外關于B.pseudomallei對哌拉西林他唑巴坦的研究相對較少。Dutta等[5]發現B.pseudomallei對哌拉西林他唑巴坦均敏感，而趙梅等[6]的結果顯示哌拉西林他唑巴坦的敏感性很高，其中21例患者使用了哌拉西林他唑巴坦聯合左氧氟沙星抗類鼻疽治療。基于上述信息，本研究應用E-test藥敏法比較收集自海南省人民醫院的109株B.pseudomallei對哌拉西林他唑巴坦、美羅培南(EUCAST敏感性判斷標準[7])和亞胺培南、強力環素、阿莫西林克拉維酸、四環素、復方磺胺甲噁唑(CLSI敏感性判斷標準[8])的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)，為臨床應用提供理論依據，并為類鼻疽病的治療提供額外選擇。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1菌株來源 收集2010年6月至2018年5月海南省人民醫院類鼻疽病確診患者各類標本中分離培養的B.pseudomallei菌株109株，并進行E-test法藥敏試驗。其中，70株來源于血液標本，8株來源于痰標本，5株來源于尿標本，26株來源于膿性分泌物標本。

1.1.2抗菌藥物 亞胺培南、美羅培南、阿莫西林克拉維酸、頭孢他啶、四環素、哌拉西林他唑巴坦、強力霉素及復方磺胺甲噁唑E-test試紙條(溫州市康泰生物科技有限公司)。

1.1.3培養基 Mueller-Hinton瓊脂培養基(M-H培養基，江門凱林公司)，5%哥倫比亞羊血平板(鄭州安圖生物公司)。

1.1.4主要儀器 Vitek 2 compact(軟件版本為VT2.R7.01)細菌分析儀及配套細菌鑒定GN卡、麥氏比濁儀、麥氏管、Vitek MS(法國生物梅里埃公司)。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 所有菌株采用Vitek 2 compact VT2.R7.01版本的GN卡進行初步鑒定，然后利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術復核，最后將菌株送往中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所采用多位點序列分型[9]進行確認。

1.2.2E-test藥敏試驗 將109株B.pseudomallei從-80 ℃超低溫冰箱中取出并復蘇，轉種于5%哥倫比亞羊血平板上，置于35 ℃培養箱中培養24 h，再將其配制成0.5麥氏濁度單位濃度菌液，按照CLSI推薦的標準紙片藥敏試驗涂抹法用棉簽蘸取適量菌液，將菌液于不同角度涂布于M-H培養基上(M-H培養基在使用前先置于35 ℃培養箱中培養15 min，使其表面干燥)，涂布完成后將試紙條具有鋸齒形凹端朝下(此端含有不同藥物濃度的藥物)，垂直插入培養基中，一個9 cm的M-H瓊脂平板可放入4條E-test試紙條，4條E-test試紙條按照十字形排列，然后將放入E-test試紙條的M-H培養基置于35 ℃培養箱內培養(16～20 h后取出)，最后進行結果判讀。根據相關文獻報道，該檢測方法被證明與金標準微量肉湯稀釋法一致[10]。

除哌拉西林他唑巴坦及美羅培南外的其他6種抗菌藥物MIC結果遵循美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2015版發布的M45-A2[8]進行解釋。美羅培南遵循2019版EUCAST歐盟藥敏試驗標準進行解釋[7]。獲得結果后再分別計算這7種有判斷標準抗菌藥物的MIC50、MIC90和無判斷標準的哌拉西林他唑巴坦的MIC50和MIC90。

1.3質控菌株 質控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)，質控結果均符合CLSI規定范圍[8]。

2 結果

2.1MIC分布 亞胺培南的MIC值主要分布在0.25～0.5 μg/mL，美羅培南的MIC值主要分布在0.5～1.0 μg/mL，頭孢他啶的MIC值主要分布在1.0～2.0 μg/mL，阿莫西林克拉維酸的MIC值主要分布在2.0～4.0 μg/mL，四環素的MIC值主要分布在1.0～4.0 μg/mL，哌拉西林他唑巴坦的MIC值主要分布在0.25～0.5 μg/mL，強力霉素的MIC值主要分布在0.25～1.0 μg/mL，復方磺胺甲噁唑的MIC值主要分布在0.5～2.0 μg/mL。見表1。

表1 109株類鼻疽伯克霍爾德菌對8種抗菌藥物MIC分布及累積率

2.2藥敏試驗結果判讀 哌拉西林他唑巴坦在CLSI上無判斷折點。根據CLSI敏感性判斷標準，所有菌株對亞胺培南、頭孢他啶及阿莫西林克拉維酸全部敏感；四環素有103株B.pseudomallei的MIC值≤4.0 μg/mL，為敏感，5株MIC值=8.0 μg/mL，為中介，1株MIC值≥16.0 μg/mL，為耐藥；強力霉素有108株B.pseudomallei的MIC值≤4.0 μg/mL，為敏感，1株MIC值≥16.0 μg/mL，為耐藥；復方磺胺甲噁唑有104株B.pseudomallei的MIC值≤2.0 μg/mL，為敏感，5株≥4.0 μg/mL，為耐藥。根據EUCAST歐盟藥敏試驗標準，美羅培南有106株B.pseudomallei的MIC值≤2.0 μg/mL，為敏感，3株MIC值為8.0 μg/mL，為耐藥；哌拉西林他唑巴坦有107株B.pseudomalleiMIC值≤0.5 μg/mL，2株為1 μg/mL。通過與CLSI藥物敏感性標準和EUCAST歐盟藥敏試驗標準比較，獲得109株B.pseudomallei對有判斷折點的7種抗菌藥物的敏感性結果，并通過計算獲得這8種抗菌藥物對B.pseudomallei的MIC50和MIC90。見表2。

表2 類鼻疽伯克霍爾德菌對7種抗菌藥的藥物敏感度和對8種抗菌藥的MIC50和MIC90對比

8種抗菌藥物的MIC50從小到大依次為哌拉西林他唑巴坦(0.25 μg/mL)<亞胺培南、美羅培南、強力霉素(均為0.5 μg/mL)<復方磺胺甲噁唑、頭孢他啶(均為1 μg/mL)<四環素、阿莫西林克拉維酸(均為2 μg/mL),MIC90從小到大則依次為哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南(均為0.5 μg/mL)<美羅培南(1 μg/mL)<復方磺胺甲噁唑、頭孢他啶、強力霉素(均為2 μg/mL)<四環素、阿莫西林克拉維酸(均為4 μg/mL)。

另外，結合臨床常用的哌拉西林他唑巴坦國產劑型及進口劑型的血藥濃度峰值(Cmax)，計算各劑型的Cmax及其與MIC50、MIC90的比值，結果見表3。

表3 哌拉西林他唑巴坦劑型及血藥濃度峰值(Cmax)與其MIC50和MIC90比值

3 討論

類鼻疽病在東南亞和澳大利亞是一種重要的公共衛生性疾病，在中國主要分布在海南、廣東、廣西等。文獻資料顯示該病在墨西哥、中美洲、加勒比海地區等非流行區逐漸增多[11]。有研究發現，B.pseudomallei感染患者在沒有及時給予正確抗菌藥物治療時死亡率高達80%，但及時給予正確抗菌藥物治療患者死亡率可降低為14%～40%[12]。因醫療水平、醫療條件的不同，該病死亡率在20%～60%不等[6]。隨著早期抗菌藥物的使用，死亡率也可降至10%以下[13]。然而，由于B.pseudomallei對多種抗菌藥物(如青霉素、氨芐西林、一代和二代頭孢、大環內酯類、氨基糖苷類、鏈霉素、多黏菌素等)天然耐藥[2]，喹諾酮類抗菌藥物雖然在體外具有輕微的抗菌活性，但治療失敗率較高[3]。因此，對于類鼻疽病的治療，可選用的藥物種類有限。目前CLSI對B.pseudomallei有敏感性判讀標準的藥物僅有復方磺胺甲噁唑、頭孢他啶、四環素、強力霉素、阿莫西林克拉維酸和亞胺培南[8]。

為給類鼻疽病的治療提供更多用藥選擇，本研究結合7種有敏感性判斷標準的抗菌藥物和哌拉西林他唑巴坦進行了試驗比較。結果發現哌拉西林他唑巴坦的MIC50和MIC90分別為0.25 μg/mL和0.5 μg/mL，MIC50小于其他7種抗菌藥物的MIC50，而MIC90除了與亞胺培南的MIC90相等之外，也均小于其他6種抗菌藥物的MIC90。該結果說明其體外抗菌活性強于其他所測藥物。

哌拉西林是一種廣譜半合成β-內酰胺類抗菌藥物，通過抑制細菌的隔膜形成和細胞壁的合成發揮殺菌作用，在體外對許多革蘭陽性和革蘭陰性的需氧菌及厭氧菌具有抗菌活性[14]。他唑巴坦又名三氮甲基青霉烷砜，是多種β-內酰胺酶的強效抑制劑。在哌拉西林他唑巴坦的配方中，他唑巴坦的存在增強并擴展了哌拉西林的抗菌譜，使該藥對許多原先對哌拉西林以及對其他β-內酰胺抗菌藥物耐藥的產β-內酰胺酶細菌有效[14]。哌拉西林他唑巴坦注射后在各種組織和體液中分布廣泛，其臨床治療適應癥也比較廣，如下呼吸道感染、細菌性敗血癥、婦科感染等。

哌拉西林他唑巴坦對于腸桿菌科細菌在CLSI上已有敏感性判斷標準，對于非發酵菌，除了銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌外，其他菌尚無敏感性判斷標準。本研究結果提示哌拉西林他唑巴坦對B.pseudomallei的MIC50和MIC90均低于已有判斷標準的亞胺培南、頭孢他啶、強力霉素、四環素、阿莫西林克拉維酸、復方磺胺甲噁唑和美羅培南，說明其體外抗B.pseudomallei活性強于其他對照藥物，結合其在體內藥代動力學的特點，發現無論是國產還是進口的多種劑型，其血藥濃度峰值都遠遠超過其MIC50和MIC90值，而一般認為，抗菌藥物的血藥濃度高于其對目標菌的MIC值4～6倍以上，在體內就有抑菌或殺菌作用。用于分析哌拉西林他唑巴坦對B.pseudomallei的敏感性標準大多參照CLSI中銅綠假單胞菌的MIC敏感折點[5]。Dutta等[5]發現來自孟加拉國的20株B.pseudomallei對哌拉西林他唑巴坦均敏感(參照CLSI中銅綠假單胞菌的MIC敏感折點)，其MIC50和MIC90均為2 μg/mL。該報道中的MIC值顯著高于本研究結果，但其樣本數量可能太少，所有分離株對3種常用抗菌藥物(亞胺培南、頭孢他啶和阿莫西林克拉維酸)的MIC50和MIC90值均較高(≥2 μg/mL，瓊脂稀釋法)。另外，董素芳等[15]亦研究了B.pseudomallei對哌拉西林他唑巴坦的敏感性，文中僅提示其參照CLSI標準判定。綜上所述，本研究仍具有一定的參考意義，為臨床應用哌拉西林他唑巴坦治療B.pseudomallei感染提供理論依據。

本研究對哌拉西林他唑巴坦體外對B.pseudomallei的MIC濃度進行初步研究，旨在引起人們對B.pseudomallei感染中抗菌藥物選擇的重視，提高B.pseudomallei感染的治愈率，降低死亡率。實驗室應與臨床緊密合作，以便獲取更多的哌拉西林他唑巴坦治療B.pseudomallei感染的臨床藥效學總結，為其治療用藥提供更有力的證據。