全球產KPC肺炎克雷伯菌的KPC分布與序列分型分析*

朱宏，沈瀚，曹小利，劉暢

(南京大學附屬鼓樓醫院檢驗科，南京210008)

隨著碳青霉烯類藥物的使用，碳青霉烯耐藥腸桿科細菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae, CRE)不斷出現和播散，導致發病率和死亡率增高，是全球面臨的嚴峻公共衛生問題[1]。流行病學研究表明，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)約占CRE的60%[2]。已知碳青霉烯水解酶KPC的產生是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯耐藥的主要機制[3]。在歐美國家，ST258是CRKP常見的流行克隆[4];在亞太地區，ST11是CRKP常見的流行克隆[3]。本研究旨在分析全球產KPC肺炎克雷伯菌的序列分型，并分析主要流行克隆與KPC-2、KPC-3間的關系。

1 材料和方法

1.1菌株 使用Aspera軟件從NCBI中下載2018年12月31日前提交釋放的肺炎克雷伯菌基因組，剔除重復提交、沒有注釋的菌株，共計5 494菌株。

1.2KPC基因的分布 采用本地blastp工具進行比對分析：用5 494個基因組的所有蛋白質編碼核苷酸序列比對NCBI上提供的40個KPC的核苷酸序列[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/isolates#/refgene/gene_family:(blaKPC)]，以蛋白質相似度>80%為閾值，分析KPC在5 494株肺炎克雷伯菌中的分布。

1.3多位點序列分型 (multilocus sequencing typing，MLST) 通過下載7個管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB的基因序列，構建多位點序列分析(multi locus sequence analysis，MLSA)數據庫。利用本地BLASTN技術，將產KPC菌株基因組中所有編碼蛋白質的核苷酸序列與MLSA數據庫進行比對，以確定菌株的序列分型(sequence types, STs)。然后通過比較MLSA曲線來確認每個菌株的ST。

1.4統計學分析 用SPSS軟件(20.0版本)進行。用皮爾遜卡方檢驗分析KPC-2、KPC-3在不同ST克隆間的流行率差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1碳青霉烯耐藥基因KPC的分布 5 494株肺炎克雷伯菌中，1 943株(35.4%)細菌攜帶14個KPC變異體。其中，以KPC-2(959/1 943，49.4%)和KPC-3(952/1 943,49.0%)為主，其余KPC-4、KPC-16、KPC-31、KPC-12、KPC-32、KPC-4、KPC-6、KPC-7、KPC-8、KPC-27、KPC-33和KPC-34占比均低于0.4%。

2.2攜帶KPC基因肺炎克雷伯菌株的ST 1 943株產KPC菌株共有115個ST，其中，996株為ST258(占51.3%)，285株為ST11(占14.7%)，259株為ST512(占13.3%)，其余ST型別占比均低于2.3%，有9株細菌為新的ST(目前的數據庫中沒有對應的ST)。

2.3KPC-2和KPC-3肺炎克雷伯菌中的ST分布 959株KPC-2肺炎克雷伯菌分布在87個ST菌株中，其中，413株為ST258(占43.1%)，274株為ST11(占28.6%)，其余ST型別占比均低于4.2%，有6株細菌為新的ST。952株KPC-3菌株分布在45個ST中，以ST258(570/952,59.9%)和ST512 (259/952,27.2%)為主，其余型別占比均小于2.1%，有3株細菌為新的ST。

KPC-2和KPC-3的主要流行克隆型見表1。

表1 KPC-2和KPC-3肺炎克雷伯菌的主要序列分型分布

2.4主要克隆菌株間攜帶KPC-2、KPC-3基因的情況 285株ST11攜帶的KPC變異體為KPC-2(n=274)、KPC-3(n=6)、KPC-12(n=3)、KPC-16(n=1)、KPC-44(n=1)。996株ST258攜帶的KPC變異體為KPC-2(n=413)、KPC-3(n=570)、KPC-12(n=1)、KPC-16(n=1)、KPC-31(n=1)、KPC-32(n=1)、KPC-34(n=1)、KPC-44(n=1)、KPC-7(n=1)、KPC-8(n=1)。259株ST512攜帶的KPC變異體均為KPC-3。 KPC-2在ST11中的分布(274/285，96.1%)顯著高于在ST258中的分布(414/996，41.6%)，差異有統計學意義(χ2=43.819，P=0.000)；KPC-3在ST512中的分布(259/259，100%)顯著高于在ST258中的分布(570/996，57.2%)，差異有統計學意義(χ2=206.645，P=0.000)。

3 討論

本研究在NCBI中檢索到40個KPC的變異體，分別從肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等多株細菌分離。然而通過分析這40個KPC變異體在5 494株細菌中的分布，只發現14個KPC變異體，這種差異可能與KPC的流行有關，因為在全球范圍內，KPC-2、KPC-3是介導肺炎克雷伯菌對碳青霉烯耐藥的主要流行酶[5]。在中國，KPC的流行以KPC-2為主[6]，而在歐美等國家，同時有KPC-2和KPC-3的流行播散[7]。此外，KPC-3分布在45個ST中，而KPC-2分布在87個ST中，表明KPC-2似乎有更廣泛的宿主菌。

MLST分析發現，1 943株產KPC菌株有155個ST，表明了該類菌株的遺傳多樣性。不過，本研究發現的ST11、ST258和ST512是產KPC肺炎克雷伯菌的主要克隆，這與國內外的報道一致[8]。目前已知，這3個克隆都屬于克隆組258，屬于國際高危流行克隆[9]，是醫療衛生機構重點監測的超級耐藥菌。此外，ST258攜帶著最多的KPC變異體，其次為ST11，而ST512只攜帶KPC-3酶，這可能意味著ST258與編碼KPC變異體的質粒之間有很好的宿主適應性。另外，本研究發現，雖然KPC-2在ST11中的分布顯著高于其在ST258中的分布，KPC-3在ST512中的分布顯著高于其在ST258中的分布，但ST258的流行與KPC-2和KPC-3分布沒有差異，這種流行分布趨于一致的情況，暗示ST258作為國際高危流行克隆，可能與KPC-2和KPC-3的分布密切相關，也表明肺炎克雷伯菌特定克隆ST258在KPC播散中的優勢，具體機制有待于進一步闡明。

總之，從全球范圍來看，KPC的流行以KPC-2和KPC-3為主，KPC-2的流行克隆菌株以ST11和ST258為主，KPC-3的流行克隆菌株以ST258和ST512為主，加強該類細菌的監測對于院內感染控制具有重要的作用。