胎盤絨毛組織中金屬蛋白酶及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

柳欒美 張?zhí)烊?郭金霞 洛陽(yáng)北方企業(yè)集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南省洛陽(yáng)市 471000

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指連續(xù)發(fā)生≥2次的自然流產(chǎn)，是育齡女性生育失敗的主要原因，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致不孕不育，對(duì)女性身心健康造成不良影響[1]。相關(guān)研究顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率占總?cè)焉锱缘?%～5%，占早期流產(chǎn)病例的30%～40%[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因目前尚未明確，已有研究報(bào)道的包括生殖器異常、免疫功能異常、遺傳、環(huán)境因素、胎兒染色體異常[3]。研究者發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)和胎盤的發(fā)育過(guò)程[4]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能夠促進(jìn)孕早期胎盤絨毛組織中血管的生成[5]。本文探討了MMP-2、MMP-9及VEGF在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織中的表達(dá)特點(diǎn)，旨在為闡明MMPs、VEGF與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 觀察對(duì)象 選取2018年3月—2019年10月間本院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者42例為觀察組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)連續(xù)性流產(chǎn)≥2次；(2)染色體檢查正常，孕周≤12周，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)家族史的患者；(2)生殖系統(tǒng)異常的患者。年齡23～38歲，平均年齡(29.40±2.72)歲；妊娠天數(shù)57～74d，平均妊娠(63.08±10.35)d。收集同期自愿終止妊娠的孕早期流產(chǎn)者39例為對(duì)照組，年齡20～37歲，平均年齡(28.71±3.05)歲；妊娠天數(shù)56～76d，平均妊娠(63.71±9.95)d。性別、年齡在兩組患者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參與并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與HE染色。兩組孕婦均行負(fù)壓吸引流產(chǎn)術(shù)終止妊娠，術(shù)中收集胎盤絨毛組織標(biāo)本，平均成兩份，將其中一份標(biāo)本放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存用于RT-PCR檢測(cè)；另一份標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液中固定后常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察兩組孕婦胎盤絨毛組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA水平檢測(cè)。Trizol法提取胎盤絨毛組織標(biāo)本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用于RT-PCR反應(yīng)模板。反應(yīng)體系共20μl：上、下游引物各1μl、cDNA 1μl、Sybr Green熒光染料10μl、雙蒸餾水7μl。引物序列由上海澤葉生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，MMP-2上游引物5’-GTGTGTGTCTACCATCCTCGCA-3’，下游引物5’-GTGTCTG TCTGCGTAATCTTA-3’；MMP-9上游引物5’-CCCTTGTAGGCCAGGTGG-3’，下游引物5’-CCTCCTCACCTCCACCCG-3’；VEGF上游引物5’-GTCGTCTTTCAA GT ACCTAGGT-3’，下游引物5’-ACACTGTTCGGTTCCGCCACT-3’。反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 2min，56℃ 40s，共40個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 2min。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF蛋白水平檢測(cè)。取胎盤絨毛組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高溫、高壓修復(fù)抗原。滴加鼠抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體，均為1∶500稀釋，兔抗人VEGF單克隆抗體(1∶300稀釋)，4℃過(guò)夜，次日滴加二抗：羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，均為1∶1 000稀釋，室溫反應(yīng)1h，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，切片脫水、透明后封片，倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image pro plus 6.0進(jìn)行定量分析，使用積分光密度(IOD)表示MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組胎盤絨毛形態(tài)規(guī)則，滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)外層結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，絨毛間質(zhì)無(wú)水腫。觀察組胎盤絨毛形態(tài)不規(guī)則，滋養(yǎng)細(xì)胞外層萎縮融合、數(shù)量減少，內(nèi)層異常增多、排列紊亂，絨毛內(nèi)血管發(fā)育不良、間質(zhì)水腫，血細(xì)胞總量減少，存在少量炎性細(xì)胞。見圖1。

圖1 兩組胎盤絨毛組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(HE，×200)

2.2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9及VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖2 兩組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白免疫組化染色(SP ×200)

2.3 觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，觀察組胎盤絨毛組織中VEGF與MMP-2、MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.695，P=0.000；r=-0.682，P=0.000)；MMP-2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.631，P=0.000)。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是常見的妊娠期并發(fā)癥，孕12周之前發(fā)生為早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，孕12～28周發(fā)生為晚期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，是不孕不育的主要原因之一，嚴(yán)重影響女性身心健康[6]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因繁多，包括遺傳因素、免疫應(yīng)答異常、胚胎發(fā)育不良等，具體機(jī)制仍未明確。近年研究認(rèn)為，孕期胎盤絨毛組織血管形成障礙、入侵蛻膜細(xì)胞滋養(yǎng)層是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要原因[7]。本文胎盤絨毛組織HE染色結(jié)果提示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胚胎絨毛血管發(fā)育不良，滋養(yǎng)細(xì)胞分化水平異常導(dǎo)致滋養(yǎng)層厚度變薄，胎盤功能不全可能是復(fù)發(fā)流產(chǎn)的原因。

金屬蛋白酶是一類依賴鋅離子、鈣離子等金屬離子發(fā)揮催化活性的蛋白水解酶，能夠降解胞外基質(zhì)。相關(guān)研究顯示，金屬蛋白酶與血管生成和侵襲性疾病的發(fā)生有關(guān)，能介導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥、惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8]。其中MMP-2、MMP-9是孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜的主要活性酶。孕早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9，降解胞外基質(zhì)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白，為滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜創(chuàng)造條件，確保妊娠持續(xù)。VEGF是促內(nèi)皮細(xì)胞分裂原，能促進(jìn)血管形成。孕期母體與胚胎的營(yíng)養(yǎng)交換基礎(chǔ)為胎盤絨毛組織血管新生。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF存在低表達(dá)，可能與孕早期自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)[9]。

本文結(jié)果顯示，觀察組胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。可推測(cè)胎盤絨毛組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)上調(diào)可能誘發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)母體子宮蛻膜基質(zhì)的過(guò)度降解，導(dǎo)致胎盤未發(fā)育完全時(shí)即從宮腔中提前脫離，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；VEGF表達(dá)下調(diào)會(huì)影響胚胎絨毛血管的正常生理功能，降低母體對(duì)胚胎的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在關(guān)聯(lián)。相關(guān)性分析顯示，觀察組患者VEGF與MMP-2、MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，MMP-2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)。提示VEGF與MMP-2、MMP-9可能共同參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展，具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。