牛肉中頭孢喹肟殘留的HPLC檢測方法的研究

阿力騰才斯克，盧 琳

（新疆維吾爾自治區獸藥飼料監察所，烏魯木齊830063）

頭孢喹肟是一種動物專用第四代頭孢類抗生素，抗菌譜廣、抗菌活性強并對β內酰胺酶高度穩定而被廣泛用于豬、牛呼吸道細菌性感染、急性乳房炎疾病的臨床治療，以提高藥物療效。畜禽養殖業是應用抗生素的主要領域之一，降低畜禽的發病率與死亡率，促進生長和提高健康養殖方面發揮著主要作用，但使用不當危害很大。畜禽糞便通過施肥方式進入土壤環境中，導致獸用抗生素從畜禽體到土壤和水環境轉移，對環境微生物形成持續性的誘導和篩選壓力從而導致獸用抗生素性基因的污染風險，對人類造成直接或間接的傷害，是人們面臨的巨大威脅。因此我國農業農村部對獸用抗生素頭孢喹肟在動物源性食品中的最高殘留量（MRL）做出了嚴格規定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Waters公司,紫外檢測器），高速冷凍離心機（德國sigma公司），（插入）EYELA旋轉蒸發儀，Sartorius分析天平:（感量0.00001 g），渦旋混勻器，DELTA 320 pH計（METTLER公司）。對照品硫酸頭孢喹肟來源：德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量93.9%，批號：G130285。HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），微孔過濾膜0.45 μm，移液器。試劑：高氯酸，乙腈為色譜純；正丙醇，正己烷，甲醇[1]。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照溶液的配制

頭孢喹肟標準儲備液（1 mg/mL）:精確稱取硫酸頭孢喹肟對照品11.85 mg置于10 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，得到1 mg/mL標準儲備液。4℃保存，有效期1個月[2]。

頭孢喹肟標準工作液（2 μg/mL）:精確量取1 mg/mL標準儲備液0.1 mL置于50.0 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液稀釋至刻度。

1.2.2 高氯酸-磷酸緩沖液

取濃磷酸3.4 mL，緩慢加適量的水稀釋再加入高氯酸鈉3.45 g，用三乙胺調至pH 3.6，用水定容至1 000 mL。

1.2.3 50%乙腈水溶液

取乙腈50 mL，用水稀釋至刻度100 mL，混勻。

1.2.4 5%乙腈水溶液

取乙腈5 mL，用水稀釋至刻度100 mL，混勻。

1.2.5 流動相

0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V）[3]。

1.3 實驗方法

1.3.1 方法原理試樣中殘留的頭孢喹肟經高氯酸鈉緩沖液及乙腈混合提取，旋轉蒸發后加水復溶，HLB固相萃取柱凈化，流動相洗脫后經高效液相色譜測定，并借助外標法完成定量。

1.3.2 色譜條件色譜柱為Waters XTerr MS C18(4.6×250 mm)粒徑5 μm，柱溫35℃；流動相為0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V），流速1.0 mL/min，進樣量50 μL，紫外檢測器，檢測波長270 nm。

1.3.3 標準曲線及線性范圍

無誤稱量2 μg/mL標準工作液0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL分別置于10.0 mL容量瓶中。濃度為10、50、100、300、500 ng/mL的標準液。將其一次上機測定，以峰面積與對應的質量濃度做出相應的曲線見圖1，展開回歸分析。

1.3.4 牛肉組織樣品的提取

無誤量取均勻的牛肉組織試料4.0 g，并將其放進50 mL具塞離心管內，加入高氯酸-磷酸緩沖液2 mL，乙腈10 mL，渦旋混勻，震蕩8 min,10 000 r/min離心5 min，取上清液于茄形瓶中，再按上述步驟重復提取一次，合并兩次上清液，加正丙醇5 mL，在40℃下旋轉蒸發近干。殘渣中加入水10 mL溶解至，再加正己烷5 mL，渦旋混勻。轉移至50 mL離心管中，4℃下10 000 r/min離心8分鐘，取下層清液備用[4]。

1.3.5 凈化

HLB小柱一次用甲醇2 mL和水2 mL活化，備用液全部過柱，再依次用水5 mL和5%乙腈水溶液5 mL洗滌，抽干后用流動相2.0 mL洗脫，收集于10 mL玻璃試管中，渦旋混勻后過0.45 μm微孔濾膜，共高效液相色譜測定。

1.3.6 方法準確度和精密度

分別精密量取含有頭孢喹肟2 000 ng/mL標準工作液0.02 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，1 mL加入4 g空白牛肉樣品中，制成頭孢喹肟為10、50、100、200，500 ng/g五個濃度相異的添加樣品，各濃度5個平行樣，重復5批次，將回收率算出。

1.3.7 靈敏度的測定

將頭孢喹肟標準工作液適量加入4 g空白牛肉組織樣品中，制成頭孢喹肟為10、15、25 μg/kg三個濃度相異的添加樣品，處理好之后，取50 μL進樣分析，從而對檢測限、定量限加以清晰明確。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

在頭孢喹肟濃度為10～500 ng/mL的時候，峰面積和濃度具有較佳的線性關系，相關系數R=0.999969，線性方程是Y=3.45×106+6.02×103。標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線圖

2.2 回收率與精密度

從表1數據可見，出頭孢喹肟在空白牛肉樣品力的回收率都在60%以上，批間相對標準偏差均≤20%，與有關規定相符[5]。

表1 頭孢喹肟藥物在牛肉中回收率和精密度的測定結果（n=5）

2.3 液相色譜圖

50 ng/mL頭孢喹肟標準品、試劑空白、牛肉樣品空白、50 ng/g陽性添加樣品的色譜圖如圖2、3、4、5。

圖2 添加50 ng/mL標準品圖譜

通過色譜圖可以看出，圖2中在5.309 min處為頭孢喹肟的色譜峰，圖3試劑空白圖譜和圖4牛肉樣品空白譜圖在允許保留時間段內均未出峰，說明所用試劑和空白樣品無污染。圖5牛肉空白樣品添加回收色譜圖中5.435 min處出現色譜峰，根據標準品出峰保留時間可以判斷其為頭孢喹肟的色譜峰。

圖3 試劑空白圖譜

圖5 牛肉空白樣品添加回收（50 ng/g）陽性色譜圖

2.4 檢測方法的靈敏度

按1.3.4和1.3.5項方法處理，當添加濃度25 μg/kg頭孢喹肟，測得頭孢喹肟藥物的信噪比s/n/<25,說明方法的檢測限可至25 μg/kg[6]。

3 討 論

3.1 紫外檢測器的選擇

對頭孢喹肟的標準溶液做紫外吸收分析，從吸光度數據可知，頭孢喹肟的最大系數出現在270 nm波長位置[7]。

3.2 提取溶劑的挑選

在提取藥物期間，將提取液擬定為有機溶劑，譬如乙腈、丙酮、甲醇等，通過數次實驗探索嘗試之后，最終決定將提取劑選定為乙腈、高氯酸鈉緩沖液。

3.3 正己烷的運用

在提取脫脂期間，分別對異辛烷、正己烷的脫脂效果展開對比，結果法案使用其中的后者脫脂之后，溶液的雜質相對更少一些，這對目標物的檢測十分有利，具有較佳的成效[8]。

3.4 提取液濃縮

在提取期間，需借助旋轉蒸發來對提取液進行濃縮，在濃縮的時候要防止蒸干，一旦全部蒸干，那么樣品就會被吸附于雞心瓶內壁，從而導致回收率受到干擾，所以僅需濃縮至最小體積[9]。

4結 論

通過高效液相色譜-紫外檢測法對牛肉組織中頭孢喹肟藥物的殘留量進行測定，此方法簡單易行、無誤性高、回收率高，檢測限亦可達成相應的要求，而且值得信賴。所以，本文所建立的頭孢喹肟在牛肉組織中的殘留檢測方法從技術層面為以后該藥的殘留監控進行有力支持，這對提高牛肉食品的質量、保障消費者健康都具有重要的意義[10]。