麥洼牦牛冷凍精液效果試驗

楊 壯，劉曉霞，趙睿驍，陳科宇，李小偉，何小強，王燕文，周凡莉，趙曉東，肖 敏，何明珠，唐 瑞，羅光榮*

（1.四川省龍日種畜場，四川 紅原624401；2.四川高原牦牛生態科技開發有限責任公司，四川 紅原624401）

麥洼牦牛（BOS MUTUS）主產于四川阿壩州的紅原、阿壩及若爾蓋縣，是川西北地區具有代表性的高原家畜，也是當地主要的生產資料[1-3]。近年來，隨著超載過牧、草原退化以及長期近親繁殖等因素的影響[4]，導致麥洼牦牛的后代生產性能逐漸降低，許多優良的基因資源沒有得到很好地挖掘利用，通過有效的保種工作，將繁殖性能高、生產性能好、抗逆性強的麥洼牦牛種質資源保存下來，防止品種資源退化，培育高產牲畜[5]成為必然。

凍精是指運用超低溫冷凍技術將動物新鮮精液保存起來，以便于精子使用和保存，是一種優良的遺傳資源保存及推廣手段[6，7]。精液冷凍技術的研究，使得精子在體外保存時間大大延長，我國從80年代初從國外引進生產冷凍精液的技術和設備，開始研究推廣液氮冷凍精液技術。根據凍精制作劑型的不同，相繼開發了顆粒凍精和細管凍精兩種劑型[8]。與細管凍精相比，在衛生方面，由于顆粒凍精完全裸露在空氣和液氮中，易污染、易破損。而細管凍精由于封閉在細管中，其被污染率大大降低。在科學標記方面[9]，顆粒凍精多為幾十粒甚至上百粒合裝，一旦散失，顆粒上既無包裝又無標記，很容易造成品種混雜，而細管凍精每支均有詳細標記，杜絕了此類事故的發生。在人工授精操作方面，顆粒凍精在人工授精時需要解凍試管、注射器及相關的消毒物品輔助進行，而細管凍精則省去了解凍液、解凍管、注射器等用具，操作較為簡易。在精液質量指標和使用效果上也有研究顯示解凍后精子活力和存活時間要顯著高于顆粒凍精[10]。精子活力強和存活時間久，說明精子存活率高，相應也會提高母牛受胎率及犢牛生產率，直接與經濟效益掛鉤?？偠灾瑥男l生、科學、操作簡便、經濟等方面分析，細管凍精比顆粒凍精有著明顯的優越性。因此，90年代后冷凍精液逐步由顆粒型轉向細管型。

目前，對麥洼牦牛冷凍精液相關研究較少，為進一步做好麥洼牦牛優秀種質資源的保種工作，2021年4月，四川省龍日種畜場與四川高原牦牛生態科技開發有限責任公司按照牛冷凍精液國家標準（GB4143-2008）方法開展麥洼牦牛細管凍精質量測評，以期達到國家標準規定，為后期優秀遺傳資源保存、開展凍精推廣等工作打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 凍精來源

麥洼牦牛冷凍精液于2020年取自四川省龍日種畜場牦牛原種場，通過人工采集所收集，精液采集后加入配平的平衡液后，暫存至-6℃車載冷凍冰箱，運送至都江堰綜合科研基地開展細管凍精制作，并保存至-193℃的液氮罐[11]。

1.2 凍精質量檢測

1.2.1 精子活力檢查

1.2.1.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、恒溫水浴鍋、5.0 mL試管、載玻片、蓋玻片、烘片機、移液槍。

1.2.1.2 檢查方法 將凍精置于37℃恒溫水浴鍋中解凍，取解凍精液20 μL置于載玻片上加蓋玻片，玻片置于恒溫于38℃的烘片機上，待放置2 min后，置于400倍熒光顯微鏡下觀察活力。每片樣觀察3個視野，進行精子活力評定。按照國家標準（GB4143-2008）要求，精子活力≥35%（即0.35）即為合格。

精子活力評價值M=n1+n2+n3/3

式中，M為活力；n1為第一視野活力；n2為第二視野活力；n3為第三視野活力。

1.2.2 前進運動精子數檢查

1.2.2.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、細胞計數板、移液槍、小試管、計數器、3.0%Nacl溶液。

1.2.2.2 檢查方法 用移液槍吸取解凍后的精液20 μL，注入盛有0.98 mL的3.0%Nacl溶液中，混勻，使其稀釋成50倍的稀釋精液。用移液槍吸取稀釋精液20 μL放于細胞計數板中，用蓋玻片蓋好，使精液自然流入計數室，均勻填充，用400倍熒光相差顯微鏡鏡檢。按照國家標準（GB4143-2008）要求，前進運動精子數≥800萬個即為合格。

前進運動精子數c=s×m

式中，c為每計量前進運動精子數；單位為個，s為每計量中的精子數，單位為個；m為活力。

1.2.3 精子畸形率檢查

1.2.3.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、載玻片、計數器、移液槍、蒸餾水、姬姆薩染液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛、甲醇、甘油。

1.2.3.2 試劑配置 磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氫二鈉（NaH2PO4·12H2O）2.25 g；雙蒸餾水定容至100 mL。中性福爾馬林固定液：40%甲醛HCHO8.0 mL；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氫二鈉（NaH2PO4·12H2O）2.25 g，用濃度為0.89%Nacl50.0 mL溶解后加入8.0 mL中和后的甲醛，再加0.89%Nacl溶液定容至100.0 mL。姬姆薩原液：姬姆薩染液2.0 g；磷酸鹽緩沖液3.0 mL；蒸餾水5.0 mL。

1.2.3.3 制片、染色、鏡檢、抹片 用移液槍取解凍后的精液20 uL，置于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈夾角，將樣品均勻的涂布于載玻片上，自然風干，風干時間約為5 min；固定：在已風干的抹片上滴上1.0 mL中性福爾馬林固定液，固定10 min后用清水沖去固定液，自然風干；染色：將姬姆薩染液滴于自然風干且固定好的抹片上，進行染色，染色10 min，用清水沖去染液，自然風干待檢；鏡檢：將處理好的抹片置于400倍熒光相差顯微鏡下進行鏡檢，每個抹片觀察200個以上的精子，進行畸形精子計數。按照國家標準（GB4143-2008）要求，精子畸形率≤18%即為合格。

精子畸形率A=A1/S×100%

式中，A為精子畸形率；A1為畸形精子數，單位為個，S為精子總數，單位為個。

1.2.4 細菌數的檢查

1.2.4.1 主要器材 培養箱、超凈工作臺、燒杯、玻棒、天平、牛角匙、高壓滅菌蒸汽鍋、培養皿、水浴箱、pH試紙（pH5.5～9.0）、棉花、牛皮紙、記號筆、紗布、放大鏡、牛肉浸膏、蛋白胨、磷酸氫二鉀、Nacl、瓊脂粉、1 moL/L氫氧化鈉、1 moL/L鹽酸、蒸餾水。

1.2.4.2 培養基的配置 胰蛋白胨10 g；酵母粉5 g；氯化鈉10 g；瓊脂粉30 g。用1 L蒸餾水定容，調節pH值至7.2～7.4范圍內，然后分裝于三角燒瓶中高壓滅菌（121℃滅菌20～30 min）[12]。

1.2.4.3 檢查方法 細管冷凍精液置于37℃恒溫水浴鍋中解凍，用酒精棉球消毒以無菌操作，一支直接注于一個滅菌平板中；把冷卻至50℃左右的普通瓊脂以無菌操作傾倒入平板中，每個平板約15 mL，倒入平板時，轉動平板使精液均勻混合。待瓊脂凝固后反轉平板，置于37℃培養箱中培養24 h取出，計數平板中的菌落個數。按照國家標準（GB4143-2008）要求，細菌數≤800個即為合格。

細菌數=每個平板中的細菌總數，不做細菌類別區分。

2 結果與分析

通過國家標準方法檢測觀察凍精樣品后，結果詳見圖1和表1。

圖1 麥洼牦牛細管凍精樣品

冷凍精液在37℃解凍后4 h內，通過鏡檢活力仍能達到35%以上（表1）；冷凍精液經過稀釋后，通過鏡檢精子密度較高；通過鏡檢，發現精子呈現出多種畸形狀態，出現尾部彎曲、頭尾折疊的畸形較多；從細菌培養結果看，精液內的細菌含量較少，細菌數遠遠低于國家標準要求。試驗結果可以看出，隨機抽取的15支牦牛凍精經過檢測均達到國家標準（GB4143-2008）要求。

表1 麥洼牦牛細管凍精質量檢測結果

3 討 論

精子是生命延續的基礎條件，運用優質的精液于生產實踐中，能夠加快畜禽品種改良、調整地區畜禽結構及豐富物種多樣性，冷凍精液保存正是優秀種質資源得以延續的重要載體。在牦牛本品種改良工作中，運用牦牛細管凍精，能加快本地生產性能較為落后的弱母畜品種復壯，縮短牦牛飼喂周期、提升牦牛生產性能，提高養殖牧戶的經濟效益[13]。

對公牛精液質量的要求與母牛受胎率有著密切的關系，而“活力”則常被作為評價精液質量的首要指標。在不同時間段不同品種公牛精子活力的比較研究中發現[14]，不管是保存時間中表現的活力，還是精子存活力指數的評價，牦牛始終保持著強勢，特別是在14 h仍保持在18%的活力，顯著高于其他各品種牛。從抗逆性方面看，生活在高寒低溫環境中的牦牛，常年的風土馴化使其產生了良好的適應性，其公牛精子在生存能力上也表現出較強的適應性和存活力。我們的試驗結果表明（表1），所有樣品的精子活力均能達到35%以上，甚至部分達到80～90%，也同樣驗證了這一觀點。

除精子活力外，牦牛冷凍精液前進運動精子數也是評價凍精產品質量的關鍵性指標之一，前進運動精子數不僅與受胎率有關，還關系到優秀種公畜冷凍精液的產量及優秀遺傳資源的利用率，在總精子數不變的情況下，有效精子數越多，受精率越高[15，16]。如表1所示，我們的所有實驗樣品中前進運動精子數均≥800萬個，說明正常功能的精子數達到足夠數量，精子的受精能力可以得到保證。

與此同時，在牦牛凍精批量生產的過程中,不能只把精子的活力和密度作為精液品質檢查的重要指標,而忽視了對畸形精子和細菌數的檢查。精子畸形率對母牛的受胎率有很大影響[17，18]，如果活力不夠、有效精子數量太低，畸形率和細菌數又太高,那么母牛的受孕率也會大大降低，因此精子畸形率以及細菌數也是保證凍精質量過關的重要指標，而我們的結果顯示（表1），精子畸形率以及細菌數遠低于國標標準，說明符合國家標準。

此外，為保證試驗結果的準確性，在實際操作過程中仍要注意以下幾點：一是在冷凍精液的保存中要注意液氮罐的密封性，防止因液氮不足而導致凍精失活；二是在細管凍精解凍后要盡快完成整個流程的質量檢測工作，抽樣數量一次性不宜抽檢過多，以免精子因長期暴露在自然條件下喪失活性降解；三是檢驗人員對精子活力的判斷要客觀，要掌握精子不同類型的畸形狀態，以免錯判；四是在配置培養基時，要注意整個配置流程均為無菌操作，以免細菌落入培養基中，影響檢測結果。

總而言之，優秀種質資源的保存不能僅僅依靠優秀種質本身，更多的要運用現代科技的技術手段，在不改變其生活狀態的前提下，開展優秀資源的挖掘及保存。凍精技術在畜牧業現代化發展進程中起到不可替代的作用，它在畜禽養殖結構調整、轉變養殖模式、畜牧業提質增效等方面具有十分重要的意義。

4 結 論

在精子總數不變的情況下，精子質量越高、活力越好，母畜受精率就越高，繁育出來的種畜質量也就越好[19]。本次試驗發現，隨機抽測的15支麥洼牦牛細管凍精均符合國家標準（GB4143-2008），由此可以說明我單位生產麥洼牦牛凍精質量良好，可用于優秀種質資源的推廣工作中。