FGF5基因編輯細毛羊的健康狀況評估

胡慧宇，任思睿，劉晨曦，韓 冰，李忠慧，瑪依拉，劉明軍，李文蓉*

（1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊830052；2.新疆畜牧科學院生物技術研究所，烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾自治區動物生物技術重點開放實驗室，烏魯木齊830011）

目前轉基因動物的潛在安全問題是人們廣泛關注的熱點問題之一。依照我國《轉基因生物安全評價管理條例》、《轉基因動物安全評價指南》，明確了轉基因動物評價應包括分子特征、遺傳穩定性、健康狀況、功能效率評價、環境適應性、轉基因動物逃逸（釋放）及其對環境的影響和食用安全7個主要方面。其中，轉基因及基因編輯動物健康狀況用一般指標、生理學指標和其他適合的指標進行評價。

基因編輯技術是一項在生物體基因組水平上對DNA序列進行定向改造的新型技術，主要包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸內切酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和規律成簇的短回文重復序列／Cas9（clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats／Cas9，CRISPR/Cas9）等介導的技術[1-3]。其中，CRISPR/Cas9技術只需較短的sgRNA序列便可引導Cas9蛋白在內源性基因組特定位點進行切割、精準編輯，相較于其它基因編輯技術具有更加高效便捷的特點[4,5]。同時，該技術不導入外源DNA序列進入動物基因組中。因此CRISPR/Cas9從理論上更加安全、更易為公眾所接受。成纖維細胞生長因子5（Febroblast Growth factor 5，FGF5）是23個FGF家族的成員之一，具有阻止毛乳頭細胞的激活和增殖，有效抑制毛發生長發育的作用[6]。目前的研究表明，FGF5與毛囊的發育和被毛的生長密切相關，能有效控制毛囊從生長期向休止期的轉化[7]。羊毛長度是綿羊重要的經濟性狀之一，屬復雜數量性狀，利用常規遺傳手段改良難度大、周期長[8]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對細毛羊FGF5基因進行靶向修飾，能有效阻斷FGF5功能，從而促進羊毛生長。

本課題組前期采用CRISPR/Cas9技術對中國美利奴細毛羊的FGF5基因進行InDel突變，成功獲得了一批相較于野生型細毛羊（即非轉基因正常細毛羊），其毛長和毛產量顯著提高的基因編輯羊[9]。為了評價FGF5基因突變后細毛羊的健康狀況，本研究比較分析了基因編輯羔羊和同齡野生型細毛羊羔羊的0、2、4、6、8月齡生長發育性狀，比較了周歲及成年的基因編輯羊與野生型羊的生理生化指標，分析了周歲基因編輯羊、成年基因編輯羊以及成年野生型羊的直腸微生物群落結構組成，旨在通過對基因編輯羊與野生型羊健康狀況的全面檢測分析，闡明FGF5基因編輯羊的生物安全性，為基因編輯動物安全評價相關法規政策的制定提供理論依據，推動FGF5基因編輯細毛羊的產業化發展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用FGF5基因編輯羊（genetically modified，GM）、野生型細毛羊（wild-type，WT）群體均飼養在新疆畜牧科學院生物技術研究所綿羊繁育基地，羊只飼養管理一致、體況健康、自由采食和飲水。挑選同一時期（相差不超過15 d）出生的FGF5基因編輯羔羊（GM，n=40）和野生羔羊（WT，n=25）用于生長發育性狀測定；分別選取成年羊（GM 54只，WT 22只）和羔羊（GM 36只，WT 13只）用作生理生化指標檢測；隨機選取3組公羊用作直腸微生物群落分析，其中成年野生型羊（A組）8只、周歲FGF5基因編輯羊（B組）6只、成年FGF5基因編輯羊（C組）8只。

1.2 實驗試劑及儀器

一次性使用真空注血管（抗凝管）、一次性使用真空采血管（普通管），購自南昌市贛達醫療器械有限公司；大動物血清生化加強診斷試劑盒，購自天亮醫療器材股份有限公司；BC2800Vet全自動動物血液細胞分析儀、BS-180邁瑞全自動血清生化檢測儀，均為深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司的產品；臺式低速離心機TD-4M，為博科控股集團有限公司的產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 羔羊生長發育性狀測定

分別在FGF5基因編輯羔羊和野生型羔羊的0、2、4、6、8月齡時，測量其體高、體斜長、胸圍和體重。具體方法如下：用尺子從測量羔羊的肩隆高到地面的垂直距離，即體高；肩胛前端至坐骨結節后端的直線距離，即體斜長；在肩胛骨后端，圍繞胸部一周的長度即胸圍。

1.3.2血液樣品采集及檢測

將羊只保定，采集約3 mL血液，立即分別注入含肝素鈉的抗凝采血管和無抗凝劑的采血管中。將抗凝血輕輕顛倒混勻，用于血常規測定。該樣品須在采血4 h內進行檢測；用于血清生化檢測的樣品需帶回實驗室，3 000 r/min離心10 min后，吸出的血清送往檢測機構進行分析。血常規檢測和血清生化檢測均由新疆畜牧科學院獸醫研究所動物中心完成。

1.3.3 直腸糞便采集及測定

清洗羊只肛門后，戴上無菌手套從肛門伸入直腸，用手指將糞摳出。使用無菌培養皿接取直腸處糞樣，再移入50 mL無菌離心管中，封口后將盛有糞樣的離心管放入預先備好的冰袋上。樣品低溫運送至北京諾禾致源生物科技有限公司，進行16S rDNA微生物群落測序。

1.3.4 統計分析

GM羊與WT羊的生長性狀、生理生化指標利用SPSS軟件進行獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異顯著；直腸微生物群落測序結果利用諾禾致源生信分析云平臺對測序有效數據進行OTU聚類和物種注釋、樣本復雜度分析、多樣本差異分析，同樣以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羔羊生長發育性狀分析

將FGF5基因編輯羔羊（GM，n=40）和野生羔羊（WT，n=25）分別于出生、2月齡、4月齡、6月齡和8月齡測定的體重、體高、胸圍和斜體長進行了數據統計和比較。從表1結果顯示，GF5基因編輯羊與野生型羊的各項指標隨羔羊月齡增長均呈上升趨勢，FGF5基因編輯羊與野生型羊不同月齡的各項生長性狀均無顯著差異（P>0.05）。

表1 羔羊的生長發育速度統計（平均數±標準差）

2.2 血常規及血清生化結果

血常規檢測各項指標中紅細胞數、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度和紅細胞體積分布寬主要檢測羊是否存在貧血；平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板計數主要檢測羊是否存在血液疾病；白細胞數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比和單核細胞百分比主要檢測羊是否存在炎癥及細菌病毒感染。血清生化檢測所選的加強診斷試劑盒中，針對羊的腎功能檢測項目有血尿素氮和肌酐，肝功能檢測項目有堿性磷酸酶、白蛋白和總蛋白，醣類代謝檢測項目有葡萄糖，電解質檢測項目有鈉、鉀、無機磷、鈣。

分別對FGF5基因編輯羊與野生型對照羊的生理生化檢測結果進行T檢驗分析。結果顯示，不論是羔羊組還是成年組，FGF5基因編輯羊與野生細毛羊的血常規各項指標以及血清生化各項指標均無顯著差異（P>0.05），如表2和表3所示。

表2 FGF5基因編輯羊與野生細毛羊血常規指標（平均數±標準差）

表3 FGF5基因編輯羊與野生細毛羊血清生化指標（平均數±標準差）

2.3 直腸微生物群落分析

2.3.1 樣品測序結果及OTU分析

將直腸糞便送至北京諾禾致源生物科技有限公司進行16S rDNA微生物群落測序。根據測序結果得出每個樣品至少產生174 476條有效數據，平均測序長度為409～413 bp。測序質量值Q20%、Q30%分別達到98%和94%以上，GC含量在52%～55%之間，測序質量合格。得到原始數據后以97 %的相似度作為一個OTU的劃分標準，對所有樣品的有效序列進行聚類，對每個OTU的代表序列進行物種注釋。共計得到了29個phylum（門），49個class（綱），99個order（目），181個family（科），344個genus（屬）和177個species（種）。

在門水平上（圖1），按照組（圖1a）和樣本個體（圖1b）分別展示，相對豐度較高的菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門），其次是Fibrobacteres（纖維桿菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Spirochaetes（螺旋體門）。以上菌門豐度占據總豐度96.2%以上，A、B、C、三組間無顯著差異。

圖1 羊直腸糞便菌群門水平的分布

在科水平上（圖2），按照組（圖2a）和樣本個體（圖2b）分別展示，在三組樣本中Ruminococcaceae（瘤胃菌科）、Ruminococcaceae（理研菌科）、Ruminococcaceae（克里斯滕森菌科）、Lachnospiraceae（毛螺旋菌科）、Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Akkermansiaceae（疣微菌科）、Bacteroidaceae（擬桿菌科）是豐度最高的菌科。不論是基因編輯羊還是野生型羊的直腸微生物群落中Ruminococcaceae、Ruminococcaceae、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae這四個菌科均占優勢。

圖2 羊直腸糞便菌群科水平的分布

2.3.2 α多樣性分析

將所有樣本繪制稀釋曲線（圖3）和等級聚類曲線（圖4），每個圖中右上角標出每個樣本所對應的曲線顏色。在稀釋曲線圖3中，每個樣本使用對應顏色的曲線表示，用來反映測序深度情況。橫坐標代表了隨機抽取的測序條數，縱坐標為根據測序條數量可構建的OTU數量。如圖所示每個樣本的曲線已經趨于平緩，說明測序數據量漸進合理，增加測序深度和數據量只會產生少量新的物種，對觀測新的OTU的影響不大。在等級聚類曲線圖4中，每個樣本使用對應顏色的折線表示。橫坐標為OTUs豐度排序的序號，縱坐標為對應OTUs的相對豐度。如圖4所示，每個曲線在橫軸的寬度和在縱軸的平滑程度所反映的豐富度和均勻度差異不大，沒有陡峭曲線所反映的優勢菌種。

圖3 樣本稀釋曲線

圖4 樣本等級聚類曲線

在分析樣本內多樣性中，常用的α指數有Shannon指數、Simpson指數、Chao指數、Ace指數、Goods_coverage指數。其中用來反映菌群豐富度的有Chao指數和Ace指數；用來衡量群落多樣性的有Shannon指數以及Simpson指數；Goods_coverage指數則是用來反應測序深度。為分析基因編輯羊與野生對照羊的群落差異和基因編輯羊成年與周歲間群落差異，按照A組（野生型成年羊）與C組（基因編輯成年羊），B組（基因編輯周歲羊）與C組（基因編輯成年羊）的分組模式進行α多樣性指數組間差異分析Ttest檢驗（表4），可以看到每組的Ace，Chao1，Simpson，Goods_coverge和Observed_species指數P值均大于0.05，均無顯著性差異。

表4 各指數組間T-test檢驗結果

2.3.3 β多樣性分析

通過主成分分析（PCA分析）比較組間群落結構差異。分析結果如圖5a所示，A組野生型成年羊對應實心正方型，C組基因編輯成年羊對應空心正方型，兩組各樣本分布趨勢較近，群落組成較相似。但存在個別偏離樣本，如C組的GM18022、GM18090；如圖5b所示，B組基因編輯周歲羊對應實心正方型，C組基因編輯成年羊對應空心正方型，兩組樣本間分布趨勢較近，群落組成較相似。但同樣存在偏離樣本，如C組的GM18090。在兩組比較中，GM18090個體都與主群較遠，但其它個體無論是GM羊還是WT羊均聚為一類。

圖5 PCA分析

進一步利用ANOSIM相似度分析進行評價，計算A、B、C組間差異大小及顯著性。R-value是ANOSIM檢驗的統計量，介于-1和1之間。R-value大于0且越接近1，說明組間差異越大、組內差異越小；R-value小于0且越接近-1，說明組內差異大于組間差異；當R-value=0時，說明樣本的分組屬于隨機分配，分組無統計意義。統計分析的可信度用P-value表示，P<0.05表示統計具有顯著性。由表5可知，成年的基因編輯羊與野生型羊的組間比較（A-C）R-value為0.193說明分組具有統計意義，且P值為0.069大于0.05，組間差異不顯著；基因編輯羊成年與周歲的組間比較（B-C）R-value為-0.053，說明樣本分組屬于隨機分布，且P值為0.665大于0.05，組間差異不顯著。這說明基因編輯成年羊與周歲羊的直腸群落結構基本無差別。提示，基因編輯羊的腸道微生物群落結構與其年齡無關。

表5 ANOSIM結果

2.3.3 組間差異物種分析

LEfSe(LDA Effect Size)能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的Biomarker，從而能夠識別不同豐度的特征以及相關聯的類別。在閾值為3的情況下，從下圖6可以看出C組（基因編輯成年羊）的彎曲桿菌科（f_Campylobacteraceae）和彎曲桿菌屬（g_Campylobacter）為優勢菌，均屬于革蘭氏陰性菌，常與綿羊腸胃炎等疾病相關；A組（野生型成年羊）的瘤胃菌屬（g_unidentified_Ruminococcaceae）和另枝菌屬（g_Alistipes）為優勢菌。其中，瘤胃菌屬為腸道內常見益生菌，另枝菌屬為革蘭氏陰性菌，與炎癥疾病相關菌。

圖6 LEfSe分析

為了進一步證實基因編輯羊腸道群落與年齡無關，本實驗又進行了基因編輯羊不同年齡組的LEfSe分析。在閾值設為3的情況下，沒有找到具有顯著差異的Biomarker。

LDA值分布柱狀圖中展示了LDA Score大于設定值3的物種，即組間具有統計學差異的Biomarker。展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小（即為LDA Score）。

3 討 論

轉基因動物的健康評估一直是轉基因動物安全評價最重要的組成部分之一。目前我國對轉基因動物健康狀況評價一般分為表型評價和非表型評價[10]。首先對轉基因動物的表型如外貌、行為、生長發育速度等進行評價；其次對已知表型健康的轉基因動物進行生理學檢測、腸道微生物檢測、生殖激素檢測等一系列技術手段對其進行非表型評價。為此，本研究采用了生長發育性狀檢測、生理生化指標檢測以及直腸微生物群落結構分析對FGF5基因編輯羊進行綜合性健康評估分析。

血液生理生化指標能在不同程度上反映出器官功能的變化及疾病的發生與發展情況，對了解動物的生理狀態具有重要意義。血常規通常檢測紅細胞、白細胞、血小板等多項指標。其中紅細胞具有黏附、殺傷抗原，清除免疫復合物，參與集體免疫調控等作用，其功能發揮主要靠血紅蛋白[11]；白細胞包含淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等，是動物血液中極為重要的免疫細胞?？梢院艽蟪潭壬戏从硠游锸欠翊嬖谘装Y及細菌病毒感染；血小板等參數在正常范圍內是恒定的，對炎癥反應、傷口愈合、血栓形成等生理過程中具有重要作用[12]。血清生化指標可以反映動物機體的健康情況。如肝功能損害型疾病可檢測血清中的白蛋白、白蛋白和堿性磷酸酶；腎功能疾病可檢測血清中的血尿素氮和肌酐[13]；葡萄糖水平檢測間接反映動物胰島功能[14]；血清中的無機鹽電解質檢測也可以反映動物的多項生理功能。本研究比較了基因編輯羊與野生對照羊的成年時期和幼年時期的生理生化檢測結果，其血常規檢和血清生化檢測的各項參數均沒有差異。揭示了FGF5基因的突變未對細毛羊的健康產生影響。這與蔡文濤[15]對轉ATⅢ基因、轉IFNβ基因、轉HBs Ag基因山羊與非轉基因山羊檢測的生理學指標相似的結果一致。

腸道微生物群落對機體的免疫功能、消化功能和抗病力等有著重要的影響。在轉基因動物健康評估實驗中，可以通過糞便間接獲取機體的腸道微生物群落結構，從而反映機體的營養代謝水平。此外，腸道微生物群落還會受到許多其它因素的影響，比如動物年齡[16]、動物健康[17]和飼養模式[18]等。因此，本研究分別比較在同一飼養模式下基因編輯羊的成年與周歲之間的腸道群落差異和均已成年的基因編輯羊與野生對照羊的腸道群落差異。從結果來看，基因編輯羊與野生對照羊的腸道群落基本無明顯差異。李隴平[19]等人利用CRISPR/Cas 9介導的MSTN/FGF5基因編輯陜北白絨山羊與野生對照羊的腸道糞便菌群分析中發現，兩者之間不存在顯著差異，這與本研究結果一致；而在不同年齡的分組比較下，基因編輯羊的腸道群落也不存在差異，但其個體分組屬于隨機分布。由此推測，周歲基因編輯羊的腸道發育已經完善，與成年羊基本無差別，但還需進一步證實。從LEfSe分析結果看到，基因編輯羊具有統計學差異的微生物標志物為彎曲桿菌科和彎曲桿菌屬，彎曲桿菌可與宿主共生或致病，是世界上從細菌角度引起胃腸炎的最常見病因。目前還未有報道解釋內源基因的改造與腸道內彎曲桿菌增多之間是否有關。在野生型對照羊的微生物標志物中，瘤胃菌屬為腸道內常見益生菌，而另枝菌屬為革蘭氏陰性菌是一種較新的細菌屬，常與炎癥疾病相關。然而，上述四種菌均屬于反芻動物腸道內的常見菌。說明FGF5功能的缺失未改變細毛羊腸道微生物菌群的總體結構。

4 結 論

本研究分析結果初步證實，FGF5基因功能的缺失并未對羔羊的生長發育速度造成影響。FGF5基因編輯羊和野生對照羊的生理生化各項指標和腸道微生物群落無顯著差異。FGF5基因編輯羊自身健康狀況良好，為轉基因動物生物安全評價奠定基礎，推動了FGF5基因編輯細毛羊的產業化發展。