中性粒細胞胞外誘捕網與牙周炎高凝狀態的相關性研究

劉 歡,于 洋,王 哲，祝 率，付 薔，胡騰龍1,

慢性牙周炎(CP)是牙周組織的慢性進行性炎癥,長期的炎癥環境導致牙齒周圍支持組織的喪失,最終牙齒脫落,咀嚼功能紊亂,嚴重影響患者的生活質量[1]。作為口腔最常見的疾病之一,牙周炎影響了約46%的成年人[2]，在國內的發病率高達80%[3]。研究表明,牙周炎不僅是局部的病變,還與多種系統性疾病的發生有關，是心血管疾病發生的危險因素之一[4-5]。

在牙周炎患者病變局部存在大量的細菌,中性粒細胞作為機體的第一道防線,首先到達感染部位,發揮防御作用,在感染的牙齦上皮以及齦溝液中存在大量的中性粒細胞。2004年Brinkmann等[6]首次發現,中性粒細胞受到刺激可產生類似網狀的結構——中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs),主要發揮捕獲細菌的防御功能。隨著對NETs研究的深入,發現NETs本身的網狀結構和其上附著的多種酶導致凝血紊亂,在多種疾病的血栓形成中發揮作用[7-9]。因此,本研究以牙周炎患者的中性粒細胞為研究對象,觀察其釋放的NETs對重度牙周炎患者凝血指標的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月—2019年12月,于哈爾濱醫科大學附屬口腔醫院牙周科就診的20例重度牙周炎患者作為重度牙周炎組,以20例牙周健康者作為正常對照組。本研究經過哈爾濱醫科大學倫理委員會審核批準,所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

選取標準:重度牙周炎:至少有一個牙齒鄰間部位的牙周探診深度(probing depth, PD)≥5 mm,至少有兩個不在同一牙齒的鄰間部位的臨床附著喪失(clinical attachment loss, CAL)≥6 mm。正常對照組選取標準:PD≤3 mm,牙齦無炎癥，無牙槽骨吸收。所有患者至少保留18顆牙齒,并且第三磨牙和需要拔除的牙齒不計算在內[10]。排除標準:心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、免疫性疾病等系統性疾病；吸煙；懷孕或者正在哺乳期的婦女；半年內接受過牙周治療；6個月內有外傷或拔牙史者；3個月內使用過抗生素、類固醇或非甾體類抗炎藥。

1.2 牙周檢查

對所有研究對象進行牙周檢查,每顆牙都檢查6個位點:頰側(近中、中、遠中),舌側(近中、中、遠中)。用Williams牙周探針,檢測牙齦指數(gingival index, GI)、PD和CAL水平。為了保證每一位患者檢測的臨床指標的可靠性,本實驗由一位專業的牙周科醫生對所有研究對象進行牙周檢查,并記錄相關指數。

1.3 血樣采集

所有參與對象上午8:00—10:00采集空腹肘靜脈血于兩管枸櫞酸鈉抗凝管中,每管5 mL。一份送至本院檢驗科進行凝血指標檢測,包括凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、D-二聚體(D-dimer)、纖維蛋白原(fibrinogen，Fbg)；另一份用于中性粒細胞的制備和檢測外周血中的NETs標志物髓過氧化物酶-DNA(myeloperoxidase-deoxyribonucleic acid, MPO-DNA)和胞外DNA(cell-free DNA, cf-DNA)。所有參與對象均是在牙周治療前完成血樣采集。

1.4 制備中性粒細胞

血液采集后,在30 min內,利用一步離心法獲得中性粒細胞。利用Polymorphprep中性粒細胞分離液,450×g離心40 min,提取中性粒細胞。將細胞重懸在RPMI 1640中,500×g離心5 min,最后將細胞重懸于含有3%胎牛血清的RPMI 1640中,細胞的最終密度為1×106個/mL。用臺盼藍和流式細胞儀評估中性粒細胞，生存力>99%,純度>94%[9]。

1.5 ELISA檢測

cf-DNA和MPO-DNA代表NETs的水平。用Quant-iT-PicoGreen-dsDNA檢測試劑盒(Invitrogen)檢測牙周炎患者血漿中cf-DNA的水平,根據說明書進行操作。采用ELISA捕獲法測定血漿中MPO-DNA復合物的含量。

1.6 免疫熒光

將中性粒細胞(1×106個/mL)接種到賴氨酸包被的24孔板上,在含5% CO2的室溫環境下,用50 nmol/L的十四烷酸佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激3 h后,用4%多聚甲醛固定中性粒細胞,2%牛血清白蛋白(BSA)封閉,加入小鼠抗人的彈性蛋白酶、髓過氧化物酶抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜。第2天吸走一抗,PBS洗3次,加入兔抗鼠的彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)抗體和髓過氧化物酶(MPO)抗體(1∶100),室溫下敷育0.5～1.0 h,PBS洗3次,每孔加入100 μL的DAPI,通透5 min,再用PBS洗1～2次,每次5 min。摳片,防淬滅的甘油滴在載玻片上,將細胞面朝下,扣在載玻片上,用指甲油封片。在熒光顯微鏡下觀察NETs結構[9]。通過雙盲實驗統計每100個細胞所釋放的NETs比例，每次結果均由兩人觀察得出，并且每項測試進行3次[11]。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析。牙周炎組與正常對照組的GI、PD、CAL、PT、APTT、D-dimer、Fbg等指標的組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Spearman相關性分析對MPO-DNA、cf-DNA與PD、CAL、Fbg、D-dimer的相關性進行分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料

我們選取20例無系統性疾病的重度牙周炎患者,包括11例男性,9例女性,平均年齡為(56.73±6.81)歲。尋找年齡和性別匹配的對照組,包括11例男性,9例女性,平均年齡為(53.52±9.24)歲。性別和年齡不存在統計學差異(P>0.05)。

對研究對象進行牙周檢查發現(表1),重度牙周炎組的GI較對照組明顯增加(P<0.05)。重度牙周炎組的牙周指標PD顯著高于對照組,兩者之間的差異具有統計學意義(P<0.001)。通過對比CAL更顯示重度牙周炎組牙槽骨吸收非常嚴重(P<0.001)。

表1 重度牙周炎與對照組牙周指標的對比

2.2 重度牙周炎組外周血中NETs標志物明顯升高

我們通過檢測cf-DNA和MPO-DNA間接反映NETs水平。通過ELISA實驗測定兩組外周血中的cf-DNA和MPO-DNA,結果發現,重度牙周炎組的cf-DNA水平顯著高于對照組(P<0.01)，重度牙周炎組的MPO-DNA比對照組顯著升高(P<0.05)，具體見表2。

表2 重度牙周炎與對照組外周血中NETs標志物對比

2.3 重度牙周炎組的中性粒細胞更易釋放NETs

在免疫熒光顯微鏡下,可見重度牙周炎組外周血的中性粒細胞經過刺激后釋放大量的NETs(圖1),應用免疫熒光顯微鏡觀察中性粒細胞周圍存在大量的絲網狀結構,進一步確認NETs結構。對照組中只存在少量的NETs,說明不同來源的中性粒細胞的活性存在差異,重度牙周炎患者的中性粒細胞處于明顯活躍狀態。

圖A、B是應用50 nmol/L的PMA刺激中性粒細胞3 h后，通過染色在免疫熒光顯微鏡下觀察NETs結構；A：對照組的中性粒細胞受到刺激后，未見明顯的NETs結構；B：重度牙周炎組的中性粒細胞受到刺激后，可見明顯的NETs結構(如圖中白色箭頭所指)；C：PMA刺激不同來源的中性粒細胞，然后測定NETs釋放的百分比；D：以100個中性粒細胞為單位，觀察中性粒細胞釋放NETs的比值；藍色：DNA；綠色：彈性蛋白酶；紅色：髓過氧化物酶；**：與對照組相比P<0.01；圖中標尺=20 μm；PMA：十四烷酸佛波醇酯

2.4 重度牙周炎組的凝血指標改變

通過檢測凝血指標發現(表3),重度牙周炎組的PT與對照組相比縮短(P<0.05)；APTT在重度牙

表3 重度牙周炎組凝血異常

周炎組較對照組略有縮短,但無統計學意義(P>0.05)；重度牙周炎組的Fbg水平(P<0.01)、纖維降解產物D-dimer水平(P<0.05)較對照組明顯升高。

2.5 凝血指標與NETs指標之間存在正相關關系

通過將cf-DNA和MPO-DNA與凝血指標進行相關性分析可見,NETs指標與凝血指標之間存在明顯的正相關關系。見圖2。

A、B：將對照組和重度牙周炎組的cf-DNA和D-dimer、Fbg進行相關性分析，隨著cf-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明顯上升水平；C、D：將對照組和重度牙周炎組的MPO-DNA和D-dimer、Fbg進行相關性分析，可見隨著MPO-DNA水平的升高，D-dimer和Fbg水平呈明顯上升水平；D-dimer：D-二聚體；Fbg：纖維蛋白原；cf-DNA：胞外DNA；MPO-DNA：髓過氧化物酶-DNA過Toll樣受體，激活血小板，促進血小板活化，表達P-選擇素，釋放血小板活化因子-4，促進高凝狀態的形成[18]。

3 討 論

我們的研究發現,在重度牙周炎患者中,外周血中的NETs水平明顯升高,并且中性粒細胞處于活躍狀態,受到刺激后更易于釋放NETs。此外,我們通過對凝血指標的檢測發現,在重度牙周炎組明顯存在異常的高凝狀態,并且與NETs呈正相關關系。本研究首次驗證NETs水平與重度牙周炎患者高凝狀態的形成關系密切,這可能是其介導牙周炎與心血管疾病相互關聯的機制之一。

牙周炎與冠心病、心肌梗死、動脈粥樣硬化等心血管疾病關系密切[12-13],但是缺乏直接的證據證實。早期研究發現,牙周炎患者的凝血指標異常。PAI-1、vWF的水平隨牙周炎嚴重程度的增加而增加,機體的纖溶能力下降[14],間接證實牙周炎患者處于高凝狀態。

目前認為牙周炎與心血管疾病相關有多種機制。第一,由于細菌的長期存在,刺激機體持續的免疫反應, 免疫細胞募集到病變部位, 與細菌相互作用,釋放趨化因子和促炎因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等)，形成慢性炎癥環境。炎癥因子的增加,不僅加重組織損傷,還誘發全身性疾病[15-16]。第二，在免疫細胞遷移出血管的同時，會造成內皮損傷，破壞內皮細胞連接,增加血管的通透性，損傷的內皮細胞表達粘附分子促進中性粒細胞和血小板的募集，促進血栓形成[17]。第三,牙周致病菌可以通與健康人相比，牙周炎患者的中性粒細胞由于細菌的持續刺激，數目和反應活性均增加,并且壽命延長[19]。牙周致病菌侵入循環后，刺激中性粒細胞產生NETs。NETs的網狀結構不僅可以捕獲細菌，限制細菌的擴散,還可以捕獲各種血細胞[20]。NETs的DNA骨架上附著多種顆粒酶，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、基質金屬蛋白酶、瓜氨酸化的組蛋白等，這些顆粒酶激活凝血級聯反應，促進凝血酶的生成[7,21]。

IL-6、IL-8可以促進NETs的釋放,增加機體的凝血活性。通過中和炎癥因子或者抑制炎癥因子的生成,會降低NETs的產生[22]。當水解NETs結構,或者抑制NETs產生時,發現機體的促凝活性明顯下降[22]。說明在慢性炎癥性疾病中NETs在激活凝血級聯反應中發揮重要作用。因此,在牙周炎患者中,隨著疾病嚴重程度的增加,炎癥因子水平升高,誘發機體活躍的中性粒細胞釋放NETs增多,促進高凝狀態的形成[8-9]。

Moonen等通過對比牙周炎患者和健康人的中性粒細胞在受到相同刺激下釋放NETs的能力,結果并未發現顯著的差異[23]。但是,此項研究的牙周炎對象選取的是中重度患者,而我們的牙周炎患者均選自重度牙周炎患者,這可能是造成差異的主要原因之一。另外，患者的個體差異以及牙周炎是否處于活動期都會影響實驗結果。

研究顯示，通過牙周治療可以顯著改善內皮功能障礙[24-25]，降低系統的炎癥反應[26]。此外,牙周治療后可以提高NETs的降解率,在牙周治療3個月后,NETs的降解率提高10%[23]。由此可見,循環中的NETs在牙周治療前也可能是內皮細胞損傷的原因之一。

我們的研究排除了基礎疾病、性別和年齡對凝血系統的影響,但沒有細致區分牙周炎患者是處于靜止期還是活動期，并且樣本量較少,只研究了重度牙周炎患者,未納入牙齦炎、輕度牙周炎和中度牙周炎患者,也沒有研究NETs如何促進牙周炎高凝狀態形成的細胞分子機制。因此本研究的結論需要更大樣本量和細致的分組研究進一步證實。

本研究通過對重度牙周炎患者和健康對照組循環中NETs水平、凝血指標的分析,在排除其他基礎性疾病、性別和年齡差異的影響下,我們研究結果認為NETs影響重度牙周炎患者的促凝活性，并促進重度牙周炎高凝狀態的形成。通過研究NETs對牙周炎凝血系統的影響,為牙周炎誘發心血管疾病的發生提供新的理論機制，抑制NETs的產生或者水解NETs結構可能有助于降低牙周炎誘發心血管疾病發生的風險。