替米沙坦對尿酸鹽刺激下HK-2腎小管上皮細胞干預研究*

張繼波，龍利，覃慧群，金晟，余建峰，徐敏，劉浩

(湖北省第三人民醫院腎病內科，武漢 430033)

高尿酸血癥是引起慢性腎臟疾病的獨立危險因素，并可導致腎臟纖維化。過氧化物酶增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)與配體結合激活后，主要通過調節靶基因的表達產生生物效應，包括抑制促炎性遞質[如白細胞介素-6(IL-6)、環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)]表達，改善炎癥狀態[1]，降低轉化生長因子-β1(TGF-β1)和單核巨噬細胞因子-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)表達，起到抗腎間質纖維化作用[2-3]。單鈉尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞可以誘導HK-2細胞產生氧化應激反應[4]、自噬表達增加[5]，甚至隨著尿酸鹽濃度增加，HK-2細胞增殖能力下降，導致小管細胞凋亡[6]。血管緊張素Ⅱ可下調PPAR-γ表達[7]，替米沙坦具有激活PPAR-γ受體的作用[8]，通過提高血清、腎組織中PPAR-γmRNA表達而降低肥胖大鼠尿白蛋白，有腎保護作用[9]。陳艷梅等[10]通過對大鼠腎組織及HK-2細胞培養研究發現，調節人生電型尿酸鹽轉運蛋白(human electric urate transporter，hUAT)表達，替米沙坦能抑制腎小管上皮細胞TGF-β1及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達，對尿酸性腎病腎臟纖維化有一定的保護作用。這種保護作用是否是通過PPAR途徑產生，目前筆者尚未見類似報道，本研究主要通過PPAR途徑研究替米沙坦對尿酸鹽刺激下HK-2腎小管上皮細胞的干預機制，探討替米沙坦對尿酸性腎病腎保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 HK-2人腎小管上皮細胞，購自中國科學院細胞庫(中國上海)。

1.1.2試劑 胎牛血清(FBS，批號：567216)購于GIBCO公司；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四醋酸(EDTA)(批號：160526061)、青霉素-鏈霉素(批號：659R063)購于北京索萊寶科技有限公司；PPAR-γ阻斷劑GW9662(批號：062R1598T)、尿酸(批號：STBC0603V)購于美國Sigma公司；TrizolRNA提取試劑(批號：156987)購于美國Invitrogen公司；TaqTMⅡPCR試劑盒(批號：AE265988)、逆轉錄試劑盒(批號：AC32659C)購于TaKaRa公司；引物購于上海生工生物工程有限公司；羅格列酮片(規格：每片1 mg，批準文號：國藥準字H20041422)，成都恒瑞制藥有限公司；替米沙坦片(規格：每片40 mg，批準文號：國藥準字J20180016)，Boehringer Ingelhein Ellas A.E。

1.1.3儀器 二氧化碳(CO2)細胞培養箱購置于美國Thermo公司；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；CK-TKc-3倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；酶聯免疫檢測儀(芬蘭Thermol Labsystems)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；低速離心機(上海醫療儀器廠)；磁力攪拌器(蘇州國華儀器廠)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司)；微量移液器(德國Appendorf公司)；流式細胞儀(美國BD亞洲有限公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)；CFX96TM實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2細胞處理與分組 在培養條件為37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中用完全培養液培養HK-2細胞，選第3～5代細胞，取同步處于G0期的細胞，隨機分為7組，分別為對照組(培養基，NC組)、模型組[尿酸(600 μmol·L-1)，UM組]、高尿酸+替米沙坦組[尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1)，UT組]、高尿酸+羅格列酮組[尿酸(600 μmol·L-1)+羅格列酮(10 μmol·L-1)，UR組]、高尿酸+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸 (600 μmol·L-1)，UG組]、高尿酸+替米沙坦+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1)，UTG組]和高尿酸+羅格列酮+GW9662組[預先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻斷劑GW9662 處理30 min，再加入尿酸(600 μmol·L-1)+羅格列酮(10 μmol·L-1)，URG組]。各組刺激培養48 h后，細胞融合90%～95%。

1.3觀察指標與檢測方法

1.3.1流式細胞儀檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達 終止培養后收集細胞(1×106)。離心，洗滌，棄上清液，加1：100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ蛋白單克隆抗體100 μL；37 ℃水浴，離心，棄上清液，加1：20稀釋的羊抗鼠IgG-FITC 100 μL，水浴，離心洗滌，去上清液，除去未結合熒光抗體，調整細胞數為1×106·L-1，上機(FACSCalibur ，BD)檢測。實驗設正常對照：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替1：100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 單抗。陰性對照：只加1：100稀釋的鼠抗人hUAT、PPAR-γ單抗而不加IgG-FITC抗體的陰性對照。結果以陽性細胞率表示。

1.3.2流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡情況 終止培養，將培養基吸出，用PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞(1×106)。離心，棄上清液，用70%冰乙醇沉淀，4 ℃懸浮固定24 h。固定細胞經碘化丙啶綜合染料(PI、Rnase、Triton X-100)一步法染色30 min后，300目尼龍篩網濾過，上流式細胞儀檢測，檢測DNA含量，計數在G1峰前出現的DNA含量下降的亞二倍體峰的細胞數，計算出細胞凋亡率。

1.3.3Q-PCR法檢測HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達情況 Trizol法提取總RNA：RNA溶液在-80 ℃條件下保存。取RNA溶液1 μL，用紫外分光光度法于波長260 nm和280 nm處測定吸光度(A值)，A260/A280比值在1.8～2.0。逆轉錄cDNA：合成后cDNA在-20 ℃或更低溫度下保存。熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)反應：通過GenBank查找hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1序列，選取GAPDH作為內參。應用CFX96TM實時熒光定量PCR儀，進行熒光定量PCR。每個樣品設2個復孔，取平均擴增循環次數Ct值。以內參GAPDH為對照，計算相對定量ΔCt值。以對照組為對照，計算相對定量ΔΔCt值。采用相對定量2-ΔΔCt法比較三個基因的mRNA的表達差異。2-ΔΔCt代表實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數。ΔΔCt值=實驗組(目的基因Ct值-內參基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內參基因Ct值)。熒光定量PCR擴增基因引物序列，hUAT(NM_001001290.2)：上游(5′→3′)GACTTCCTAGTGGGTGTGAA，下游(5′→3′)AATGT-CATTTCCACTGAAGC，產物長度225 bp；PPAR-γ(NM_001127330.2)：上游(5′→3′)AGCCAACACTAAACCACA，下游(5′→3′)AGAAACCCTTGCATCCT，產物長度337 bp；COX-2(NM_001124348)：上游(5′→3′)TGAAA-CCCACTCCAAACACA，下游(5′→3′)TGGAACA-ACTGCTCATCACC，產物長度301 bp；MCP-1(NM_011333.3)：上游(5′→3′)AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA，下游(5′→3′)GGTGGTCCATGGAATCCTGA，產物長度103 bp；TGF-β1(NM_011577.2)：上游(5′→3′)AGCG-ACTCGCCAGAGTGGTTA，下游(5′→3′)GCAGT-GTGTTATCCCTGCTGTCA，產物長度130 bp；GAPDH(NM_001289726.1)：上游(5′→3′)CCTTCCG-TGTTCCTAC，下游(5′→3′)GACAACCTGGTCCTCA，產物長度152 bp。

1.3.4Western blotting檢測正常及高尿酸條件下HK-2上hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達 取出相應的實驗處理組的培養瓶，棄培養液，用預冷的PBS沖洗2次，按照6孔，板每孔加入裂解液100～200 μL(6 cm培養皿200～300 μL)。充分裂解，取上清液，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱。全自動化學發光分析儀中檢測，通過TANONGIS軟件讀取相關條帶灰度值。

2 結果

2.1各組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白表達 通過流式細胞儀檢測hUAT、PPAR-γ蛋白表達(以陽性細胞率表示)，PPAR-γ抑制劑聯合替米沙坦、羅格列酮干預，陽性細胞率上升(P<0.05)，較單用替米沙坦、羅格列酮比例下降(P<0.05)，提示替米沙坦無法逆轉PPAR-γ抑制后陽性細胞率減少，替米沙坦有激活PPAR-γ受體作用。見表1。

表1 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ蛋白陽性細胞率

2.2各組HK-2細胞的凋亡 應用PPAR-γ抑制劑后聯合替米沙坦、羅格列酮，凋亡率下降明顯(P<0.05)，與單用替米沙坦、羅格列酮比較，凋亡率下降減弱(P<0.05)，提示替米沙坦無法逆轉PPAR-γ抑制后所致的凋亡率明顯上升。見表2。

表2 7組HK-2細胞凋亡情況

2.3HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表達 應用PPAR-γ抑制劑聯合羅格列酮及替米沙坦，hUAT、PPAR-γmRNA表達增加(P<0.05)，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達減少，但差異無統計學意義(均P>0.05)，與單用替米沙坦、羅格列酮比較，hUAT、PPAR-γ表達減少，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達增加(均P<0.05)。提示替米沙坦無法逆轉PPAR-γ抑制后所致的hUAT、PPAR-γ表達減少，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表達增加。見表3。

表3 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表達

Tab.3 HUAT，PPAR-γ，COX-2，MCP-1 and TGF-β1 mRNA levels in seven groups of HK-2 cells

表3 7組HK-2細胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表達

組別hUATPPAR-γCOX-2MCP-1TGF-β1NC組1.00±0.071.00±0.191.00±0.371.00±0.131.00±0.07UM組0.19±0.25①0.17±0.02①3.65±0.9①4.07±0.55①5.35±0.33①UT組0.46±0.01②0.53±0.1②1.82±0.69②2.24±0.45②2.16±1.18②UR組0.46±0.04②0.83±0.13②1.47±0.31②2.51±0.67②1.99±0.67②UG組0.06±0.04①0.25±0.02①3.07±0.93①3.32±0.92①4.57±0.11①UTG組0.31±0.26③⑤0.5±0.02③⑤2.76±0.58③⑤3.2±0.71③⑤3.72±0.64③⑤URG組0.29±0.09④⑤0.38±0.05④⑤2.96±0.43④⑤3.04±0.89④⑤3.09±0.78④⑤F328.33659.3127.6576.69416.056P0.0000.0000.0010.0020.000

①與NC組比較，hUAT：t=-53.525，-421.549；PPAR-γ：t=-56.895，-62.681，COX-2：t=5.235，4.012，MCP-1：t=9.772，4.508，TGF-β1：t=22.846，56.010，P<0.05；②與UM組比較，hUAT：t=10.541，10.548；PPAR-γ：t=7.856，10.583，COX-2：t=-5.139，-5.412，MCP-1：t=-3.167，-5.706，TGF-β1：t=-5.726，-11.917，P<0.05；③與UT組比較，hUAT：t=-5.102；PPAR-γ：t=-3.562，COX-2：t=3.327，MCP-1：t=1.579，TGF-β1：t=4.120，P<0.05；④與UR組比較，hUAT：t=-66.732；PPAR-γ：t=-9.097，COX-2：t=7.431，MCP-1：t=3.036，TGF-β1：t=3.20，P<0.05；⑤與UG組比較，hUAT：t=8.513，16.234；PPAR-γ：t=13.650，7.184，COX-2：t=-3.720，-3.025，MCP-1：t=-3.106，-12.657，TGF-β1：t=-2.275，-3.325，P<0.05。

①Compared with NC group，hUAT：t=-53.525，-421.549；PPAR-γ：t=-56.895，-62.681，COX-2：t=5.235，4.012，MCP-1：t=9.772，4.508，TGF-β1：t=22.846，56.010，P<0.05；②Compared with UM group，hUAT：t=10.541，10.548；PPAR-γ：t=7.856，10.583.COX-2：t=-5.139，-5.412，MCP-1：t=-3.167，-5.706，TGF-β1：t=-5.726，-11.917，P<0.05；③Compared with UT group，hUAT：t=-5.102；PPAR-γ：t=-3.562，COX-2：t=3.327，MCP-1：t=1.579，TGF-β1：t=4.120，P<0.05；④Compared with UR group ，hUAT：t=-66.732；PPAR-γ：t=-9.097，COX-2：t=7.431，MCP-1：t=3.036，TGF-β1：t=3.20，P<0.05.⑤Compared with UG group，hUAT：t=8.513，16.234；PPAR-γ：t=13.650，7.184，COX-2：t=-3.720，-3.025，MCP-1：t=-3.106，-12.657，TGF-β1：t=-2.275，-3.325，P<0.05.

2.4HK-2 hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達 應用PPAR-γ抑制劑聯合羅格列酮及替米沙坦發現，hUAT、PPAR-γ蛋白表達增加(P<0.05)，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達減少(P<0.05)；與單用替米沙坦、羅格列酮比較，hUAT、PPAR-γ蛋白相對表達減少，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白相對表達增加(P<0.05)。提示替米沙坦無法逆轉PPAR-γ抑制后所致hUAT、PPAR-γ蛋白表達減少，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表達增加。見圖1。

1.NC組；2.UM組；3.UT組；4.UR組；5.UG組；6.UTG組；7.URG組。①與NC組比較，P<0.05；②與UM組比較，P<0.05；③與UT組比較，P<0.05；④與UR組比較，P<0.05；⑤與UG組，P<0.05。

3 討論

3.1尿酸性腎病腎間質纖維化的病理生理機制 尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞可以通過多種途徑介導腎間質纖維化，如上皮細胞轉分化[11-13]、自噬[5]、腎小管細胞凋亡[14]等，其中氧化應激反應[4]、內質網應激[12]為主要誘導機制。此外，尿酸鹽可破壞腎小管上皮細胞緊密連接蛋白的結構、功能及分布異常，導致腎小管損傷[15]。TGF-β1是致纖維化因子，通過上調MCP-1，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β等的表達[16]，誘導氧化應激反應，影響小管細胞轉分化[17-18]，抑制氧化應激，可以減少細胞凋亡[19-20]。COX-2主要產生部位在內質網和核膜，影響前列腺素的分泌，參與內質網應激，產生級聯炎癥反應[21]，減少炎癥及氧化損傷能抑制HK-2細胞凋亡[22-23]。本研究通過單鈉鹽刺激腎小管上皮細胞模型發現，與正常HK-2細胞比較，模型組細胞凋亡率上升，TGF-β1、COX-2及MCP-1mRNA、蛋白表達明顯增強，提示存在腎間質纖維化改變依據。

3.2PPAR-γ表達、病理生理學意義及羅格列酮干預機制 PPAR-γ屬II型核受體超家族，與配基(或配體)結合后調節相應基因的轉錄。生理情況下，集合管強表達，間質細胞、腎小球內皮細胞和系膜細胞弱表達[24]。腎小管上皮細胞PPAR-γ表達活性降低，TGF-β1表達上調誘導氧化應激反應[25-26]，介導細胞凋亡[27]，上調腎組織中PPAR-γ的表達，降低MMP-9和TGF-β1水平，可以起到抗腎間質纖維化的作用[28-30]。此外，激活PPAR-γ受體，可抑制促炎性遞質(如IL-6、COX-2、MCP-1)的表達[1，31]。羅格列酮作為PPAR-γ受體激活劑，通過抑制過度的腎臟局部炎癥因子MCP-1分泌、抑制TLR/NF-KB信號通路激活、下調趨化因子表達[32-33]，上調腎組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達，發揮腎臟保護作用[16，34]。本研究也觀察到UM組PPAR-γmRNA及蛋白表達明顯低于UT組，通過羅格列酮干預后，PPAR-γmRNA及蛋白表達上調，而應用PPAR-γ抑制劑后聯合羅格列酮治療，比較單用羅格列酮，PPAR-γmRNA及蛋白表達上調仍然偏低，提示單鈉鹽刺激HK-2細胞能下調PPAR-γmRNA及蛋白表達，羅格列酮具有激活PPAR-γ受體作用。本項目是基于PPAR-γ受體通路進行研究，而羅格列酮具有明確PPAR-γ受體激活作用，因此，選擇羅格列酮干預治療作為陽性對照進行觀察，如能證明替米沙坦有相似或優于羅格列酮的作用，則能進一步證實替米沙坦具有PPAR-γ受體激活機制。

3.3替米沙坦干預尿酸性腎病PPAR-γ表達立項依據 血管緊張素能下調PPAR-γ表達，血管緊張素受體拮抗劑(angiotensin receptor blockers，ARB)能抑制這種作用[7]，而且可以減輕HK-2細胞的凋亡和自噬[35]。早有研究表明，替米沙坦能夠部分激活PPAR-γ受體[36]，這種作用不依賴血管緊張素II受體阻滯作用，臨床及實驗研究發現能上調組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達，對心梗后心力衰竭、肥胖相關腎病及5/6腎切除大鼠有保護作用[9，37-38]。在尿酸性腎病研究中，可以預防或恢復尿酸所致NADPH氧化酶/ERK1/2/ET-1途徑的腎小管損傷，并作為尿酸誘導腎纖維化的有前途的治療藥物試驗證據[39]。陳艷梅等[10]通過動物及細胞研究發現，替米沙坦可以調節hUAT蛋白表達，發揮腎臟保護作用。但替米沙坦這種降尿酸、腎臟保護作用是否是通過PPAR-γ途徑來實現，其具體機制如何？筆者目前還沒有見到相關報道，因此展開此項目研究，進一步完善替米沙坦對尿酸性腎病的腎臟保護機制。

3.4項目研究的意義 本研究建立尿酸鹽刺激腎小管上皮細胞模型發現，腎小管上皮細胞表達PPAR-γ減少，羅格列酮、替米沙坦均能上調PPAR-γ表達，抑制PPAR-γ受體后給予羅格列酮、替米沙坦干預，并不能逆轉PPAR-γ減少，因此論證替米沙坦具有羅格列酮相似激活PPAR-γ受體作用。進一步對TGF-β1、MCP-1、COX-2、hUAT蛋白表達及凋亡率研究發現，替米沙坦不能逆轉PPAR-γ受體抑制后TGF-β1、MCP-1、COX-2表達及凋亡率上升，不能使hUAT蛋白表達的減少。因此得出結論，替米沙坦具有類似羅格列酮激活PPAR-γ受體機制，可能通過PPAR-γ途徑調節腎小管細胞凋亡、減少氧化應激及改善間質纖維化而起到腎臟保護作用。