美洲大蠊提取物對精神疾病患者腸道菌群影響的研究

尹春蕾，王 楠，馬瑩瑩，賈乘一，張 倩，李麗娟

（1.大理大學公共衛生學院，云南大理 671000；2.大理大學瀾湄人類健康研究中心，云南大理 671000）

美洲大蠊Periplaneta americana（L.），俗稱蟑螂，其提取物具有抗腫瘤、增強免疫、保肝、促進組織修復，如血管再生和創面愈合等藥理作用〔1-2〕。有實驗表明美洲大蠊對小鼠的腹瀉有抑制作用〔3〕，提示美洲大蠊可能對小鼠的腸道菌群起到改善作用。人類腸道菌群中存在著大量的微生物和寄生蟲，健康的菌群環境有利于維持機體功能的正常運轉〔4〕。2008年Romijn等〔5〕提出腦-腸軸這一雙向調節軸概念，并有研究證明腦-腸軸的功能紊亂對人類的健康會產生很大的影響，對于精神疾病患者，腦-腸軸調節在其病程中發揮著一定的作用〔6〕。本文以精神疾病患者為研究對象，通過觀察美洲大蠊提取物對精神疾病患者發作期與控制期腸道菌群影響的差異，探索美洲大蠊提取物對其腸道菌群環境是否有影響，對美洲大蠊可能的適應證領域進行初步探索。

1 材料和方法

1.1 藥品美洲大蠊提取物為云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室自制，批號編號：PKA，棕褐色液體，-20 ℃保存。

1.2 試劑與儀器大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）；肉膏酵母葡萄糖瓊脂培養基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，含氯霉素）；磷酸鹽緩沖液（PBS）等。超凈工作臺；電子天平；分析天平；恒溫培養箱；快速全自動高壓蒸汽滅菌器；厭氧培養系統；低溫冰箱（BCD-226ST C,海爾公司）；培養皿；三角瓶；酒精燈；pH試紙；立式超低溫保存箱（DW-86L386,海爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 采樣 2018年6月至8月在大理州第二人民醫院選取19例新住院的精神疾病患者作為研究對象，包括精神分裂癥（schizophrenia，SCH）和雙相情感障礙（bipolar affective disorder，BPD）兩類患者。納入標準：患者符合《精神障礙診斷與統計手冊》（第5版）〔7〕SCH和BPD診斷標準，由兩名精神科醫生共同認定確診，且入院1個月前均無用藥史。排除標準：合并高血壓、糖尿病、心臟病、胃腸道疾病等其他系統性疾病。對患者發作期和控制期的糞便分別進行采樣，其中將發作期的樣本分為空白組和實驗組（向樣本中加入美洲大蠊提取物），控制期為陽性組（臨床用藥）。

1.3.2 微生物共培養 用滅菌棉簽取200 mg新鮮糞便于EP管中，加入1.8 mL滅菌的PBS，立即將EP管封口，在振蕩器上振蕩5 min，使糞便均質化，此為初始濃度儲備液。在初始濃度儲備液里吸取200 μL溶液，放入含有1.8 mL滅菌的PBS的EP管中，振蕩均勻，此為10-1濃度溶液。依次類推，按同樣的稀釋方法將上述振蕩好的標本進行10 倍稀釋至10-8濃度溶液。根據預實驗的結果，選擇3~4個適合的稀釋度，分別取100 μL于各選擇性培養基上，用簡單涂板法均勻涂布后培養，每個稀釋度均設3個重復。待菌落長出后，以菌落形態、生化反應鑒定所需目的菌，對各培養基上的菌落數量進行計數。培養條件及鑒定方法見表1。

表1 3類微生物的培養條件及菌落計數方法

1.3.3 菌落計數 培養好的菌落經鑒定后計算糞便中菌落數量（CFU/g）。需氧菌、厭氧菌的培養選擇菌落數范圍在30~300個菌落的平板進行計數，真菌的培養選擇菌落數范圍在10~150個菌落的平板進行計數。選擇在菌落數范圍內的稀釋度溶液進行菌落計數，按下式計算出同一稀釋度溶液的平均菌落數（X）。標本菌落數量（CFU/g）=（10X×稀釋倍數）/標本質量（g）。結果用lg（CFU/g）表示。

1.4 統計學分析采用 SPSS 23.0 和 Excel 2003 進行統計學分析，各檢測數據計量資料用表示。各組數據比較依據資料的性質，對符合正態方差齊的數據進行方差分析，對不符合正態方差齊的數據進行秩和檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌落計數

2.1.1 不考慮人口特征對菌落計數的影響 在不考慮人口特征的情況下，需氧菌空白組的菌落數為（8.39±1.06） CFU/g，實驗組的菌落數為（10.18±0.80）CFU/g，陽性組的菌落數為（9.77±0.76）CFU/g；厭氧菌空白組的菌落數為（8.83±0.86）CFU/g，實驗組的菌落數為（10.62±0.39）CFU/g，陽性組的菌落數為（10.30±0.38）CFU/g；真菌空白組的菌落數為（4.41±0.92）CFU/g，實驗組的菌落數為（6.48±0.80）CFU/g，陽性組的菌落數為（6.16±0.80）CFU/g。

2.1.2 不同人口特征對菌落計數的影響 按照性別、疾病分期和疾病類型將19例患者進行分類，對需氧菌、厭氧菌和真菌的不同組別分別計數。菌落計數結果見表2。

表2 不同人口特征分組中菌落計數結果（）

表2 不同人口特征分組中菌落計數結果（）

分組性別 疾病分期 疾病類型男性（n=14） 女性（n=5） 首發（n=10） 再發（n=9） BPD（n=10） SCH（n=9）需氧菌空白組 8.30±0.91 8.66±1.50 8.60±0.90 8.17±1.23 8.59±1.15 8.04±1.10需氧菌實驗組 10.04±0.82 10.57±0.62 10.22±0.64 10.14±0.98 10.34±0.72 9.92±1.06需氧菌陽性組 9.66±0.79 10.10±0.61 9.88±0.64 9.65±0.89 9.91±0.66 9.50±1.02厭氧菌空白組 8.97±0.79 8.46±1.01 8.87±0.75 8.79±1.01 8.95±0.86 8.85±0.86厭氧菌實驗組 9.89±1.08 10.60±0.38 10.62±0.32 10.63±0.47 10.69±0.28 10.46±0.45厭氧菌陽性組 10.63±0.41 10.44±0.36 10.26±0.37 10.34±0.39 10.32±0.38 10.24±0.44真菌空白組 4.61±0.91 3.83±0.75 4.14±0.76 4.70±1.04 4.41±0.98 4.45±0.96真菌實驗組 6.59±0.83 6.16±0.67 6.45±0.46 6.51±1.09 6.60±0.63 6.56±1.00真菌陽性組 6.23±0.86 5.98±0.66 6.06±0.63 6.28±0.98 6.29±0.54 6.17±1.12

2.2 3類微生物樣本菌落數兩兩比較差異在不考慮人口特征分組的情況下，3類菌群的3組樣本菌落數差異均有統計學意義（F需氧菌=21.463，F厭氧菌=38.803，F真菌=33.384；P均為0.000）。對各類菌群的3組樣本菌落數差異進行兩兩比較，3類菌群空白組與實驗組，空白組與陽性組的菌落數差異均有統計學意義（P均為0.000）；需氧菌實驗組與陽性組菌落數差異無統計學意義（P=0.478），厭氧菌實驗組與陽性組菌落數差異無統計學意義（P= 0.267），真菌實驗組與陽性組菌落數差異無統計學意義（P= 0.767）。

在考慮性別、疾病分期和疾病類型人口特征分組下，3類菌群的3種樣本菌落數差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。進一步對各樣本菌落數的兩兩比較顯示3類菌群空白組與實驗組、空白組與陽性組（除女性和SCH特征的需氧菌組）的菌落數差異均有統計學意義（P<0.05）；實驗組與陽性組的菌落數差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表3 3類菌群的3種樣本菌落數在不同人口特征下的差異分析

表4 3類菌群的3種樣本在不同人口特征分組下兩兩比較的差異分析

3 討論

3.1 實驗結果分析由實驗結果可知3類菌群的3種樣本在不分組和分組情況下其空白組與實驗組、空白組與陽性組的絕大部分菌落數差異均有統計學意義（P<0.05），實驗組與陽性組的菌落數差異均無統計學意義（P>0.05），可認為美洲大蠊提取物對病患腸道菌群有明顯的影響。由表4可知，女性和SCH特征中需氧菌空白組和陽性組的菌落數差異無統計學意義（P>0.05），這可能與病患治療過程中的用藥劑量、實驗中實驗組的藥物劑量有所不同和用藥時長不同有關。

3.2 腦-腸軸雙向調節目前在精神疾病的發病機制研究中更多的學者偏向腸道菌群對精神疾病的影響。有研究表明腸道菌群可以通過腦-腸軸這一雙相調節軸對精神疾病進行調控，當其失調時會影響神經系統和免疫系統的發育進而造成多種精神疾病的發生〔7-8〕。

由實驗結果可知空白組、實驗組與陽性組分別對比后體現的統計學差異說明美洲大蠊提取物對精神疾病患者的腸道菌群起到了調節的作用，而且精神疾病患者本身癥狀的緩解也會使其腸道菌群結構發生改變。這個結果在一定程度上驗證了精神疾病患者的腦-腸軸的互相調節功能〔9〕。合理解釋了抗精神病藥物治療后會對患者的腸道微生物菌群種類和數量發生改變的現象〔10〕。

3.3 藥理作用和疾病治療精神藥物的使用會造成患者白細胞計數異常、流涎、高泌乳素血癥、體溫調節障礙以及胃腸功能失調等副作用〔11〕。從莊紅艷等〔12〕對精神藥物不良反應的調查分析中可知消化系統的不良反應最常見。有實驗證明美洲大蠊提取物對小鼠的免疫功能有修復作用，并且不會損傷其正常的免疫功能〔13〕。根據美洲大蠊提取物具有調節免疫的藥理作用、免疫異常是SCH的病因假說之一、腦-腸軸雙向調控這三點依據，可以推測：在這兩類精神疾病治療中，使用美洲大蠊提取物來源的相關藥物和常規治療藥物聯合使用，可以通過改善人體的免疫功能和腸道菌群的狀態來治療精神疾病，同時改善患者的消化系統不良反應。

本文僅為美洲大蠊提取物對精神疾病患者腸道菌群的影響進行初探，是對腸道菌群的整體研究，其具體作用及調控機制尚不清楚，有待下一步研究說明。