基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化作用機(jī)制研究

李 捷，陳依春，李舉發(fā)，陳臨濤，王嘉喆，姜伊娜，張斌濤

（1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712082；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046；3.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉手術(shù)部，陜西咸陽(yáng) 712000）

肝硬化是一種或多種慢性肝病長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)展,導(dǎo)致肝臟炎癥、持續(xù)纖維化、假小葉、再生結(jié)節(jié)以及血管增殖為主要病理特征，并且持續(xù)惡化而形成的一種疾病〔1-2〕，該病早期需及時(shí)有效地控制，否則容易引發(fā)肝腹水和肝癌，嚴(yán)重者將威脅患者生命〔3〕。

冬蟲(chóng)夏草（Ophiocordyceps sinensis）又稱(chēng)“蟲(chóng)草”，生于蟲(chóng)草蝙蝠蛾等的幼蟲(chóng)體上，主要分布于我國(guó)西藏、青海、四川、云南、甘肅等海拔4 000 m以上的高山灌叢和高寒草甸等地，是我國(guó)重要的名貴藥材之一。有研究顯示，冬蟲(chóng)夏草對(duì)肝纖維化、肝硬化等不同程度肝損傷具有明確的治療作用，但其治療肝硬化具體的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確〔4-5〕。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)迅速發(fā)展的背景下，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對(duì)藥物多成分作用靶點(diǎn)以及疾病靶點(diǎn)間相互關(guān)系構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，進(jìn)而對(duì)藥物作用的機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行預(yù)測(cè)的一種現(xiàn)代化研究手段〔6-7〕。本研究運(yùn)用該方法篩選冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化作用靶點(diǎn)及活性成分，建立成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），分析冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的作用機(jī)制和相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)建立在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“冬蟲(chóng)夏草”為關(guān)鍵詞，檢索該藥物的化學(xué)成分，以類(lèi)藥性（DL）≥0.14，口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，通過(guò)篩選，收集化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息。將查找條件設(shè)置為“Homo Sapiens”“Reviewed”靶基因，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）進(jìn)行規(guī)范化處理；將疾病靶點(diǎn)查找條件設(shè)置為“l(fā)iver cirrhosis”，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）進(jìn)行檢索。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用上述各檢索結(jié)果，將所得疾病與成分間靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化作用靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。為進(jìn)一步獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)，將篩選出的交集蛋白信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白相互作用信息選取置信度≥0.9，并剔除游離點(diǎn)，將篩選數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，通過(guò)計(jì)算匯總，構(gòu)建PPI。

1.3 GO功能和KEGG通路富集分析本研究通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶蛋白進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，在PPI網(wǎng)絡(luò)中說(shuō)明靶蛋白在通路和基因功能中的相關(guān)作用。

2 結(jié)果

2.1 冬蟲(chóng)夏草主要活性成分篩選通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出冬蟲(chóng)夏草化學(xué)成分共12個(gè)，將無(wú)靶點(diǎn)成分去除，共得到6個(gè)活性成分。見(jiàn)表1。

表1 冬蟲(chóng)夏草活性成分參數(shù)

2.2 構(gòu)建冬蟲(chóng)夏草活性成分治療肝硬化的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步對(duì)冬蟲(chóng)夏草活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)檢索，共獲得87個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肝硬化相關(guān)的靶點(diǎn)4 350個(gè)。二者映射后獲得冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)56個(gè)，分別為HTR2A、ALDH3A1、ALDH2、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、BAX、BCL2、ALOX5、ABCA1、ADRB2、GLB1、CASP3、CASP8、CASP9、CDK4、CETP、F7、F10、COL1A2、C1R、PLA2G4A、DRD1、CCND1、GABRA1、GABRA2、GABRA6、G6PD、IGHG1、UCP2、MAPK1、PRKACA、ABCC4、CHRM3、OPRM1、NOS2、PPARG、PTEN、PIK3CG、PECAM1、EGF、PGR、PTGS1、PTGS2、PRKCA、SELP、RXRA、RXRB、PON1、SLC6A3、SLC6A4、JUN、TGFB1、TRPM5、TNFRSF1A和TNFRSF1B。

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的56個(gè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)及6個(gè)活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，圖中清晰直觀地呈現(xiàn)疾病靶點(diǎn)與藥物成分之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中，深色圓圈代表化合物，淺色圓圈代表靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，圖中可見(jiàn)62個(gè)節(jié)點(diǎn)，形成82個(gè)關(guān)系對(duì)。“自由度”代表圖中某一節(jié)點(diǎn)直接作用的節(jié)點(diǎn)數(shù)，值的大小說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。本研究中，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)平均自由度為2.65，這表明冬蟲(chóng)夏草成分中存在成分與靶點(diǎn)間相互作用的情況。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)果分析顯示，6個(gè)活性成分的靶點(diǎn)數(shù)在均值以上，其中自由度≥11 的活性成分共3個(gè)，分別是花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇，由此表明，這些活性成分均能通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)而對(duì)疾病產(chǎn)生治療作用；自由度≥3 的靶點(diǎn)有 RXRA、PTGS2、PTGS1 ，存在于多個(gè)活性成分中，這說(shuō)明冬蟲(chóng)夏草成分-靶點(diǎn)間存在著復(fù)雜的作用關(guān)系。見(jiàn)表2。

表2 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.5 PPI的構(gòu)建與分析將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，導(dǎo)入 Cytospase 3.2.1軟件，可得到由45個(gè)靶點(diǎn)組成的59個(gè)蛋白相互作用關(guān)系圖。同時(shí)根據(jù)節(jié)點(diǎn)的“自由度”設(shè)置顏色，顏色越深代表“自由度”越大。結(jié)果表明，關(guān)鍵蛋白涉及MAPK1、RXRA、CASP8、RXRB、PPARG、BCL2、JUN、PRKCA等，即藥物治療肝硬化，通過(guò)這些關(guān)鍵蛋白與多個(gè)蛋白的相互作用，從而達(dá)到治療效果。見(jiàn)圖2。

圖2 相關(guān)靶點(diǎn)PPI圖

2.6 GO 功能富集分析GO 功能富集分析是通過(guò)生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成對(duì)基因進(jìn)行富集分析，共得到23個(gè)條目（FDR<0.01）。見(jiàn)表3。生物過(guò)程主要包括藥物反應(yīng)，雌二醇反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)以及老化過(guò)程的調(diào)節(jié)；細(xì)胞組成主要影響細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能主要涉及蛋白同源二聚化、酶結(jié)合和藥物結(jié)合。根據(jù)FDR值由小至大排序，列出前20個(gè)GO功能條目。見(jiàn)圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的GO富集情況圖（FDR排名前20）

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的GO功能條目（FDR < 0.01）

2.7 KEGG通路富集分析本研究通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)56個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，來(lái)分析冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)在信號(hào)通路中的作用，共得到44條信號(hào)通路（P< 0.01），按照FDR由小到大排列，見(jiàn)表4。其中10條直接與肝硬化相關(guān)，分別是含血清素的神經(jīng)突觸、細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、黏著斑激酶、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路及HIF-1信號(hào)通路等 。采用E Chart（http://www.ehbio.com/ImageGP/）對(duì)通路富集情況進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 KEGG通路富集分析

表4 冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化相關(guān)通路（P < 0.01）

3 討論

肝硬化是肝臟疾病長(zhǎng)期持續(xù)受損的一種終末臨床期表現(xiàn)，在非傳染性疾病中，晚期肝硬化已成為威脅生命的重要疾病〔8〕。目前治療肝硬化臨床常用藥物主要有抗病毒保肝類(lèi)藥物、保鉀排鉀利尿類(lèi)藥物等〔9-11〕，這些藥物只能在一定程度上緩解肝功能失代償，但副作用較大，因此開(kāi)發(fā)有效治療肝硬化藥物迫在眉睫。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)特色藏藥冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的有效成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步分析，以期為臨床研究提供思路。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路出發(fā)，通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出6個(gè)活性成分，其中，花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇等是冬蟲(chóng)夏草發(fā)揮藥效的主要成分。花生四烯酸是一種不飽和脂肪酸，也是人體內(nèi)主要的脂肪酸，具有抗炎和提高免疫的作用〔12〕。十八烯酸為不飽和脂肪酸，分離于貓兒眼塊莖中，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用〔13〕。β-谷甾醇是幾種廣泛研究的植物甾醇類(lèi)之一，具有降低血清膽固醇代謝作用〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而顯著降低細(xì)胞活力〔15〕。這些成分可能是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子抵御腫瘤侵襲抗肝癌作用的主要成分〔16〕,從而有效降低肝硬化向肝癌的轉(zhuǎn)變概率。結(jié)合成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出56個(gè)藥物治療肝硬化的相關(guān)靶點(diǎn)，包括PTGS1、PTGS2、RXRA、ADRB2等主要靶點(diǎn)，其中PTGS1和PTGS2即環(huán)氧合酶1（COX1）和環(huán)氧合酶2（COX2），它們?cè)谘装Y反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻鳎琈APK1、RXRA是冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的潛在靶蛋白，這些靶蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期及信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程〔17〕。

GO功能分析表明，冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化相關(guān)靶點(diǎn)主要富集在藥物反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、血管生成、酶結(jié)合、細(xì)胞增殖正調(diào)控等過(guò)程。KEGG通路富集表明，這些靶點(diǎn)直接與肝病相關(guān)的通路有乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病等。同時(shí)還與炎癥相關(guān)通路，如PI3K-Akt、MAPK、腫瘤壞死因子、HIF-1、FoxO、VEGF等信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，從而影響肝硬化的發(fā)生發(fā)展。

冬蟲(chóng)夏草治療肝硬化的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以及GO、KEGG富集分析表明冬蟲(chóng)夏草有效成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，主要通過(guò)影響多個(gè)生物過(guò)程以及信號(hào)通路間相互作用，從而起到治療肝硬化的作用。