多糖糖基化大豆蛋白質(zhì)功能特性及在食品加工中應用研究進展

張功圣

（哈爾濱市海澳斯生物科技開發(fā)有限公司，哈爾濱 150010）

大豆蛋白質(zhì)對改善食物的質(zhì)地、口感、風味、顏色和營養(yǎng)等方面起著重要作用，對食用品質(zhì)、營養(yǎng)價值及功能特性密切相關(guān)，主要包括水化性能、表面特性和蛋白質(zhì)分子間的相互作用。水化性能主要體現(xiàn)在水溶性、粘度和持水能力（WHC）三個方面。乳化性和起泡性是表面特性的主要特征。蛋白質(zhì)分子間的相互作用包括絮凝、沉降、凝膠和成膜性等。每種特性在食品加工中都有其特定的功能，如豆腐加工中的水溶性和凝膠性。從本質(zhì)上講，這些功能特性與氨基酸組成、分子大小、分子結(jié)構(gòu)、電荷分布和蛋白質(zhì)濃度密切相關(guān)。然而，蛋白質(zhì)的這些功能特性會隨著環(huán)境條件的改變而改變，如pH、溫度、離子濃度、蛋白酶的存在等。然而，在某些環(huán)境中蛋白質(zhì)類食品的食用質(zhì)量降低，限制了天然蛋白的應用。因此，對蛋白質(zhì)進行修飾被認為是增強天然蛋白質(zhì)功能特性的最佳途徑。

蛋白質(zhì)改性的目的是在不改變主要功能和營養(yǎng)特性的情況下，通過適當?shù)姆椒ǜ淖兩贁?shù)化學基團或分子結(jié)構(gòu)來提高目標功能。一般的改性方法有物理法、化學法、生物法或酶法。其中，酰化、磷酸化、脫氨、烷基化、糖基化等化學方法具有較好的有效性和針對性。然而，大多數(shù)化學修飾都存在反應過度和生成有毒物質(zhì)的缺點。多糖糖基化修飾具有反應過程溫和，改性產(chǎn)物穩(wěn)定，不產(chǎn)生有害產(chǎn)物等優(yōu)點，因此被認為是最有前途的修飾天然蛋白功能特性的方法。

與單糖、雙糖和寡糖對蛋白質(zhì)的糖基化相比，多糖對蛋白質(zhì)的糖基化顯示出更優(yōu)越的功能特性。多糖糖基化蛋白質(zhì)集天然蛋白和多糖的功能特性于一體，拓寬了天然蛋白在食品加工中的應用。20世紀90年代以來，蛋白質(zhì)糖基化的研究得到了廣泛的開展，至今仍是蛋白質(zhì)修飾領域的研究熱點。糖基化后大豆蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、持水性、凝膠性、熱穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、抗原性都得到了改善。毒理學和營養(yǎng)學研究表明，多糖糖基化蛋白質(zhì)具有無毒的特性，除賴氨酸外，大多數(shù)氨基酸保持不變。

本文綜述了大豆蛋白質(zhì)糖基化的研究進展，包括糖基化原理、多糖糖基化大豆蛋白的方法、功能性質(zhì)的修飾和糖基化大豆蛋白（GSP）在食品加工中的應用等，以期為食品蛋白的品質(zhì)改善提供新的理論指導和研究思路。

1 食物蛋白質(zhì)糖基化作用機理

蛋白質(zhì)糖基化通常被認為是美拉德（Maillard）反應的起始步驟。美拉德反應也稱為非酶褐變反應，大致包括初期、中期和末期三個階段。它是發(fā)生在食品體系中的復雜反應，如羰基化合物與氨基化合物之間的縮合、分子重排、降解、醛醇縮合、聚合等，從而影響加工食品的風味、色澤和營養(yǎng)。

蛋白質(zhì)與多糖很容易地在溫和條件下完成糖基化反應，如溫度低于天然蛋白質(zhì)的變性溫度和適宜的相對濕度（RH）。在一定條件下，蛋白質(zhì)中的氨基特別是賴氨酸的ε-氨基與多糖中的還原性羰基通過共價鍵發(fā)生縮合，形成N-糖基胺并失去一分子水。這種不穩(wěn)定的N-糖基胺發(fā)生不可逆的Amadori電子重排，形成與1-氨基-1-脫氧酮糖結(jié)構(gòu)的蛋白綴合物（見附圖）。這個反應不會改變天然蛋白的整個分子結(jié)構(gòu)，保持原有功能屬性，而且在多糖的幫助下功能特性會增強。

附圖 蛋白質(zhì)與多糖糖基化反應機制

多糖與單糖或雙糖相比，由于其還原性較弱而分子空間位阻較強，限制了美拉德反應高級產(chǎn)物生成，并阻止多糖蛋白復合物（PPC）在蛋白質(zhì)糖基化過程中的分解[1]。因此，PPC被認為是加工新型食品的一種成分，具有安全、健康的特點。

2 大豆蛋白與多糖復合物的制備

大豆蛋白和多糖是常見的生物大分子，在室溫下皆為固體、可溶于水。制備大豆蛋白與多糖復合物的主要方法有干熱法、濕熱法以及在濕熱法基礎上發(fā)展起來的其他方法[2]。

2.1 干熱法

蛋白質(zhì)糖基化首先由Kato等人[3]通過干熱法進行，該方法大致包括底物混合、加熱處理、反應停止和蛋白質(zhì)多糖復合物收集[1,4]。簡單地說，將蛋白質(zhì)和多糖水溶液按一定比例混合、脫水，適當條件下（時間、溫度和相對溫度RH）進行糖基化，立即冷卻到環(huán)境溫度終止反應。一般來說，干熱法制備蛋白質(zhì)多糖復合物不需要額外的反應底物，反應條件容易控制，不產(chǎn)生有毒有害產(chǎn)物，偶聯(lián)物接枝度高等優(yōu)點。

反應溫度、相對濕度（RH）、時間、底物質(zhì)量比、蛋白質(zhì)和多糖種類是影響干熱法的最重要因素。溫度越低，反應時間越長，反應控制越困難；較高的溫度容易誘發(fā)美拉德反應的中期階段和末期階段的發(fā)生，增加了糖基化大豆蛋白的復雜性,降低其安全性。一般情況下，蛋白糖基化選擇的溫度為40～60℃。近五年的國內(nèi)研究者主要采用50～60℃。

控制相對濕度可以提供蛋白質(zhì)糖基化發(fā)生所需的適當水活性。因此，RH的選擇主要取決于蛋白質(zhì)和多糖分子之間的接枝難易程度或反應底物的類型。通常，RH的控制是通過將飽和鹽水溶液放入密閉的干燥器中進行，在干燥器中蛋白質(zhì)糖基化用干熱方法進行。例如，溴化鉀，氯化鈉和亞硝酸鈉飽和水溶液提供的RH分別為79%，75%和65%。，近五年國內(nèi)研究者主要采用飽和溴化鉀（RH 79%）進行干熱反應。反應時間直接影響蛋白質(zhì)糖基化的接枝程度。通常，反應時間與溫度密切相關(guān)，反應溫度越高，反應時間越短。另外，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和多糖的類型也影響反應時間長短。

任孟珂等人[5]將葡聚糖和大豆分離蛋白（SPI）以2:1的比例進行混合，在相對濕度為79%飽和KBr溶液下，60℃下使SPI進行糖基化。其產(chǎn)物接枝比較高，褐變程度中等；與SPI相比，糖基化之后大豆蛋白的溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性均有不同程度的提高。彭秀清[6]也研究了大豆球蛋白與大豆多糖的干熱糖基化的條件。多位研究人員已經(jīng)確定了大豆分離蛋白、大豆球蛋白與多糖的糖基化反應條件，并且提高了大豆蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、抗原性等特性，具體反應條件的功能特性見附表。

附表 近幾年大豆蛋白質(zhì)糖基化方法及功能性質(zhì)改善

2.2 濕熱法

大多數(shù)研究都采用干熱法進行糖基化反應。然而由于干熱法要求物料干燥，反應時控制濕度和溫度，反應時間長達幾周。從工業(yè)的角度來看，干熱法造價昂貴，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，限制了糖基化產(chǎn)物作為食品原料的市場前景。濕熱法可使大豆蛋白質(zhì)與多糖在幾個小時內(nèi)完成反應。當糖基化反應在水溶液中進行時，蛋白質(zhì)在高溫下很容易變性聚合。尤其當反應物濃度較高時，隨著糖基化產(chǎn)物增加，會導致蛋白質(zhì)變性和聚合。多糖分子的空間位阻作用阻止蛋白質(zhì)的熱變性和聚集，從而在氨基和羰基之間形成共價鍵，保證了蛋白質(zhì)糖基化的有效發(fā)生。

杜沁嶺等人[7]利用不同分子質(zhì)量的萄聚糖與大豆11S蛋白在80℃下反應1～5 h，進行濕熱糖基化反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕法糖基化反應有利于提高大豆11S蛋白質(zhì)的溶解性、乳化穩(wěn)定性、持水性，而降低了其乳化性、持油性和表面疏水性。王喜波等人[8]研究葡聚糖在30～90℃濕熱條件下糖基化大豆分離蛋白和大豆分離蛋白水解物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚結(jié)后的蛋白樣品的凍融穩(wěn)定性顯著升高、出油率下降、乳析指數(shù)下降。

2.3 酶交聯(lián)方法

酶交聯(lián)方法也是蛋白質(zhì)和多糖完成糖基化反應的有效方法。微生物轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶（MTGase）已經(jīng)被用來糖基化大豆蛋白。谷氨酰胺（酰基供體）和賴氨酸（酰基受體）肽殘基之間的酰基轉(zhuǎn)移反應，脫酰胺基和交聯(lián)可被MTGase催化，以形成分子間或分子內(nèi)的ε-（γ-葡萄糖酰胺基）-賴氨酸異肽鍵，最終使蛋白質(zhì)交聯(lián)。交聯(lián)蛋白分子中的賴氨酸殘基可以很容易地被伯胺取代，這意味著MTGase可以間接催化谷氨酰胺殘基（酰基供體）和伯胺（酰基受體）之間的反應。具體的方法為MTGase促使大豆蛋白質(zhì)與多糖溶液發(fā)生美拉德反應，反應后在85～90℃下加熱使酶失活[9,10]，終止反應。MTGase催化法具有反應過程溫和，結(jié)合物定向接枝的優(yōu)點。

2.4 其他非熱處理方法

非熱處理技術(shù)，例如超聲波、脈沖電場和高壓處理，輔助經(jīng)典的濕熱法也是蛋白質(zhì)糖基化重要方法。超聲波輔助濕熱法是一種促進蛋白質(zhì)糖基化反應的良好手段。與天然SPI和濕熱法制得的SPI-阿拉伯膠共軛物相比，超聲輔助濕熱法制得的SPI-阿拉伯膠共軛物具有更好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，在蛋白質(zhì)等電點（pI）上具有更好的溶解性[22]。用高壓輔助濕法加熱得到的β-伴大豆球蛋白-葡聚糖結(jié)合物比用經(jīng)典濕熱法得到的結(jié)合物具有更好的乳化性[23]。宋旸和劉影[11]采用微波輔助糖基化改性大豆分離蛋白以提高SPI的乳化性。通過單因素實驗研究微波時間、大豆分離蛋白與葫蘆巴膠質(zhì)量比、糖基化反應時間、反應溫度對改性大豆分離蛋白乳化性的影響，并運用響應面法優(yōu)化微波輔助糖基化改性大豆分離蛋白的最佳工藝條件，研究結(jié)果顯示，微波3 min、SPI與葫蘆巴膠質(zhì)量比1∶3、58℃處理41 min時，改性大豆分離蛋白乳化性達到最高，糖基化程度達到最佳的水平，與只進行微波改性的大豆分離蛋白相比，乳化性提高了51.33%，乳化穩(wěn)定性提高了294.14%；與未改性的大豆分離蛋白相比，乳化活性提高了88.67%，乳化穩(wěn)定性提高了788.84%。利用紅外光譜和紫外光譜表征改性產(chǎn)物，結(jié)果表明大豆分離蛋白與葫蘆巴膠發(fā)生了糖基化反應。

3 在食品中的應用

大豆蛋白與多糖進行糖基化改性后其溶解性、乳化性、pH穩(wěn)定性、活性載體能力、凍融穩(wěn)定性、持油性等功能特性均有不同程度的提升，此外，與天然蛋白相比，多糖糖基化大豆蛋白的過敏性降低、抗菌性和抗氧化活性增強。因此擴展了大豆蛋白質(zhì)在食品領域的應用范圍。

3.1 溶解性提高

蛋白質(zhì)優(yōu)異的功能性發(fā)揮需要徹底將其溶解。因此，蛋白質(zhì)溶解度的增加有利于改善其他物理化學和生物學性質(zhì)。大多數(shù)天然蛋白質(zhì)在其等電點周圍或極端pH范圍表現(xiàn)出水溶解度較差。基于糖基化后蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和溶解度增強，干熱法制得的SPI-葡聚糖偶聯(lián)物水化并與其他成分混合后，采用噴霧干燥法制備了固體飲料。與SPI固體飲料相比，由SPI-葡聚糖結(jié)合物制成的固體飲料具有更好的重構(gòu)性能。

3.2 穩(wěn)定乳液體系

蛋白質(zhì)的乳化特性使其可以用作多相食品的成分，以增加其營養(yǎng)價值，食用質(zhì)量和保質(zhì)期。然而，在實際的食品加工過程中，例如在具有高酸度或高鹽離子濃度的食品體系以及食品的冷卻或冷凍處理過程中，在特殊的環(huán)境條件下，天然蛋白的乳化性能通常會減弱。與天然蛋白相比，糖基化大豆蛋白具有乳化性和乳化穩(wěn)定性增強的優(yōu)點，它可以用來穩(wěn)定乳液體系，因此其在食品加工中具有更優(yōu)越的應用潛力。

3.3 微膠囊或納米凝膠的制備

在高溫、高鹽濃度、強酸或強堿、氧化和還原劑存在的條件下，大多數(shù)生物活性化合物在食品加工過程中不穩(wěn)定或容易破壞。另外，由于它們的水溶性或油溶性差，限制其在營養(yǎng)強化食品中的應用。為了克服熱敏感性、揮發(fā)性、氧化性和極性差異，這些生物活性化合物通常被包裝材料包裹，這些包裝材料通常是使用具有成膜性和凝膠性的生物大分子制造的。

蛋白質(zhì)可以形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒，具有出色的負載能力和穩(wěn)定性。因此，這些新穎的包裝材料可用于攜帶各種生物活性化合物，以防止由不合適的環(huán)境因素引起的不利影響。糖基化的大豆蛋白質(zhì)可以用來制備微膠囊，用于包裹生物活性物質(zhì)。另外，糖基化大豆蛋白還可以起到穩(wěn)定納米凝膠，傳遞生物活性化合物的功能。

3.4 在其他食品中應用

除了保護生物活性化合物的功能外，糖基化蛋白質(zhì)還可以與水不溶性生物活性化合物反應，從而將它們間接溶解在水中。因此，糖基化后天然蛋白質(zhì)提供了一種新型的蛋白質(zhì)成分，可生產(chǎn)出具有優(yōu)良食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值的食品。

SPI通常用于提高肉制品質(zhì)量。但是，常用的高溫處理（例如煮沸和熱滅菌）會大大削弱SPI的功能特性。與SPI-葡萄糖綴合物混合的肌原纖維蛋白顯著改善乳化性能和表面疏水性[12]。與天然蛋白質(zhì)相比，糖基化蛋白質(zhì)在肉制品中的應用效果更佳，尤其是改善肉制品的持水性和嫩度方面。

4 結(jié)論與展望

目前的食品市場急需通過科學技術(shù)來修改食品成分的加工特性，從而擴寬現(xiàn)有食品資源。最有效的技術(shù)之一是蛋白質(zhì)糖基化。適當?shù)奶腔螅烊坏鞍踪|(zhì)的溶解度、乳化性質(zhì)、起泡性質(zhì)、凝膠性質(zhì)、熱穩(wěn)定性和生物學功能得到顯著改善。糖基化大豆蛋白質(zhì)在天然蛋白質(zhì)的pI附近、高溫和高鹽濃度等環(huán)境下也可表現(xiàn)出出色的加工特性。基于這些改進的功能，糖基化大豆蛋白被用于制造納米乳劑、納米顆粒和納米凝膠，作為載體來封裝和輸送生物活性化合物，以提高其穩(wěn)定性、功能和生物活性。此外，糖基化天然蛋白質(zhì)還可用于制造新型食品（例如流動食品，膠凝食品和三維印刷食品）和可降解包裝材料。