三七總皂苷聯合氨基胍治療對糖尿病腎病大鼠腎功能血CRP TNF-α MDA和SOD水平的影響

鄭杰洪，鄭映苗，陳鳳梧

(汕頭大學醫學院第一附屬醫院，廣東 汕頭 515041)

炎癥反應貫穿于糖尿病腎病的產生、發展的整個過程，在這個過程血漿中C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子含量明顯增高，可能是糖尿病腎病較強的預示因素[1]。并且，近年來許多研究證實，氧化應激反應在糖尿病腎病的發生、發展中同樣發揮著重要作用[2]。因此筆者推測，通過抗炎癥和抗氧化應激反應，能夠抑制轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達，抑制腎臟纖維化，延緩糖尿病腎病進展。三七為傳統中藥，其使用已經有近2000年的歷史，三七總皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)從其中提取多種皂苷類成分綜合體，具有降低血液黏度、降低血脂、改善微循環及強大的抗氧自由基作用[3]。但單一藥物作用效果有限，臨床傾向采用藥物聯合進行治療。氨基胍(Aminoguanidine，AG)是緩解糖尿病腎病進展的一種非酶糖基化抑制劑，可通過阻礙糖基化終末產物(Glycosylation end products， AGEs)的形成來延緩病情進展[4]。目前，關于PNS、AG對糖尿病腎病大鼠的炎癥反應、氧化應激反應及病理改善方面的研究十分匱乏。因此，本研究主要觀察PNS聯合AG對糖尿病腎病大鼠腎臟病理性造成的改變，探究其對糖尿病腎病大鼠血漿中CRP，TNF-α濃度影響和氧化應激反應的影響，為糖尿病腎病的治療提供依據，研究結果如下。

1 材料與方法

1.1動物:清潔級6周齡SD雄性大鼠75只(廣州南方醫大實驗動物科技發展有限公司)，重(180±25)g。飼養環境：溫度(23±2)℃，相對濕度50%～60%，通風、安靜。

1.2分組造模:將試驗大鼠按清潔級分籠喂養，適應性喂養1周后，將大鼠按隨機數字表法分為正常對照組15只及實驗組60只。試驗組對大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素溶液進行造模，對大鼠腹腔內注射等量枸櫞酸鹽緩沖液。4周后采用血糖分析儀(美國強生)檢測大鼠血糖、尿糖、24h尿量和24h尿蛋白，血糖≥16.7mmoL/L，尿糖持續3d以上3+則表示糖尿病大鼠造模成功，24h尿量大于造模前50%及24h尿蛋白排泄(UAE)>30mg為糖尿病腎病造模成功。本試驗中有52只造模成功，成功率為88.33%，將造模成功的大鼠按照隨機數字表法簡單隨機分為4組，各13只。平衡喂養3d后，開始給藥，給藥時間和劑量參考文獻[4]。PNS組采用100mg/kg/d的PNS進行灌胃治療；AG組采用100mg/kg/d的AG進行灌胃治療，聯合組采用100mg·kg-1·d-1的PNS和100mg·kg-1·d-1的AG進行灌胃治療；正常對照組和模型組采用相同量的生理鹽水灌胃處理。所有大鼠分籠飼養，飲水進食均自由，不予以任何降血糖藥物。各組均連續給藥8周，期間無大鼠死亡。

1.3腎組織病理切片觀察:第4周時，將大鼠處死，取雙側腎臟組織，將部分腎臟組織置于4%多聚甲醛中處理、固定，石蠟包埋、切片處理后，常規方法實施病理PAS染色。電子顯微鏡觀察各組腎臟組織病理形態變化，并采用雙盲法進行評估。將PAS染色組織切片放大400倍，每只大鼠隨機選取10個腎小球，測量腎小球平均截面積(A)，并計算腎小球容量(V)。V=β/K×A3/2，β=1.38，K(形態系數)=1.1。

1.4指標檢測:①血糖檢測:采用血糖分析儀檢測各組血糖水平。②血肌酐、24h尿蛋白檢測:采集大鼠腹部主動脈血液，采用HF-3800全自動生化分析儀(康宇醫療器械有限公司)檢測血肌酐水平；采用代謝籠采集大鼠處死前1d的24h尿液，采用馬斯亮蘭法檢測24h尿蛋白含量。③血漿CRP、TNF-α水平檢測:取腹部主動脈血液，加速離心后，分離出血漿，采用免疫散射比濁法檢測血漿CRP，采用免疫放射法檢測TNF-α水平。④血清MDA、SOD水平檢測:取腹部主動脈血液，加速離心，獲取血清，采用比色法測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。試劑盒均購自上海生物工程有限公司。

2 結 果

2.1各組大鼠病理改變和血糖水平比較:正常對照組腎小球外觀規則完整，系膜細胞稀少，基底膜??；腎小管形狀清晰，基底膜無改變，實驗組腎小球明顯增大，系膜細胞增加，基底膜增厚，腎小管無明顯改變；相比模型組，PNS組、AG組、聯合組腎小球病理狀態明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠病理PAS染色圖(×200)注：1a為正常對照組；1b為模型組；1c為PNS組；1d為AG組；1e為聯合組

模型組腎小球容量和血糖水平高于正常對照組(t=11.803、44.863，P=0.000<0.05)，PNS組、AG組、聯合組腎小球容量和血糖水平低于模型組，聯合組腎小球容量和血糖水平高于PNS組、AG組：差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎小球容量和血糖水平比較

2.2各組大鼠腎功能比較:模型組血肌酐、24h尿蛋白水平高于正常對照組(t=25.216、57.950，P=0.000<0.05)，PNS組、AG組、聯合組血肌酐、24h尿蛋白水平低于模型組，聯合組血肌酐、24h尿蛋白水平高于PNS組、AG組：差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血肌酐24h尿蛋白水平比較

2.3各組大鼠血漿CRP、TNF-α水平比較:模型組血漿CRP、TNF-α水平高于正常對照組(t=47.238、15.949，P=0.000<0.05)，PNS組、AG組、聯合組CRP、TNF-α水平低于模型組，聯合組CRP、TNF-α水平高于PNS組、AG組：差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血漿CRP TNF-α水平比較

2.4各組大鼠血清MDA、SOD水平比較:模型組MDA水平高于正常對照組(t=12.000、10.616，P=0.000<0.05)，SOD水平低于正常對照組；PNS組、AG組、聯合組MDA水平低于模型組，SOD水平高于模型組；聯合組SOD水平高于AG組：差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清MDA SOD水平比較

3 討 論

糖尿病腎病屬嚴重微血管并發癥，其危害較大，可逐漸損害腎功能，進展致終末期腎病，直至不可逆轉腎功能衰竭，死亡率極高，給社會和家庭帶來沉重的負擔[5,6]。糖尿病病程10年以上患者有一半左右會出現糖尿病腎病，已成為危害人類健康的危險疾病。因此探究預防與控制糖尿病腎病發展是現階段臨床和基礎研究關注的重點，對糖尿病腎病患者具有重要意義。目前糖尿病腎病治療主要包括控制血糖、血壓，使用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)，調節血脂及生活方式等[7]，但療效不盡人意。近年來，中醫已在各個疾病的治療方面取得了明顯效果，因此近年來逐漸考慮將中醫應用于糖尿病腎病的治療[8]。糖尿病腎病在中醫上氣虛血瘀，宜進行益氣養陰,活血化瘀治療。利用“滋陰補腎”中藥治療糖尿病腎病在臨床應用較為廣泛，但活血化瘀治療糖尿病腎病應用較少。PNS及AG為我國傳統藥物，具活血化瘀功效，還普遍應用于抗炎癥反應[9]。而糖尿病腎病的發生、發展本身與炎癥反應關系密切，因此考慮可將PNS和AG應用于糖尿病腎病。

本研究對鏈脲佐菌素溶液灌胃制造的糖尿病腎病大鼠模型分別予以不同治療方式，結果顯示糖尿病腎病會導致腎小球增大，系膜細胞增加，基底膜增厚，而采用PNS、AG治療會顯著改善這種病理變化；并且研究還顯示PNS、AG及PNS聯合AG均可降低腎小球容量、血糖、血肌酐、24h尿蛋白水平，其中PNS聯合AG降低效果最為顯著，與侯凱健等[10]報道結果一致。這是因為：PNS可有效減少TGF-β1表達，TGF-β1是導致腎小管上皮細胞轉分化和腎間質纖維化的重要物質，因此PNS可改善腎臟功能；而AG可特異性抑制晚期糖基化終產物，保護腎臟，抑制一氧化氮合成，從而抑制腎小球增大和系膜增生，改善腎臟功能；PNS和AG改善腎臟功能的機制不同，因此兩者聯合能從多方面多角度更好的改善腎臟功能。并且，研究還顯示PNS和AG具有改善血糖的作用，可能是因為血糖主要是靠腎臟代謝，當腎臟功能得到改善時，血糖代謝速率增加，故機體內血糖水平降低。目前糖尿病患者發生腎病的發病原理尚不清晰，但炎癥學說受到眾多學者的認可，認為炎癥在糖尿病腎病的進展中占有重要地位[11]。本研究結果顯示，糖尿病腎病大鼠中血漿CRP、TNF-α水平升高，且PNS、AG及PNS聯合AG均可降低CRP、TNF-α水平，其中PNS聯合AG降低效果最顯著，說明PNS聯合AG可明顯抑制大鼠炎癥反應，可能是改善腎功能的機制之一。分析原因可能為：CRP、TNF-α可促進TGF-β1的表達，加速腎臟損傷，而PNS具有改善微循環、消炎的作用，AG可抑制血管內皮生長因子(VEGF)表達，阻斷炎癥因子產生途徑。并且，現在研究認為，糖尿病腎病的發展不僅與炎癥因子有關，而且與氧化應激反應關系密切[12]。本研究分析各組大鼠的氧化應激反應顯示，糖尿病腎病大鼠的MDA水平高于正常對照組，SOD水平低于正常對照組，且采用PNS、AG灌胃治療可顯著降低MDA水平，升高SOD水平。SOD水平降低，MDA升高提示氧化應激水平升高，因此本研究提示糖尿病腎病大鼠氧化應激水平升高，PNS、AG可抑制氧化應激反應。可能原因為：PNS具有較強的抗氧自由基作用，AG具有較強還原性，可減少過氧化基團對活性細胞中線粒體和生物酶的侵蝕，從而抑制氧化應激反應。

綜上所述，PNS聯合AG治療對糖尿病腎病可顯著改善腎小球病理狀態和腎小球功能，降低血漿炎癥因子CRP、TNF-α水平，減輕氧化應激水平，說明PNS聯合AG治療糖尿病腎病的原理可能與降低炎癥反應和氧化應激反應有關。