秀珍菇菌絲活化培養條件優化

林 童 周燈銀 馬 博 王壽容 吳智艷，2，3 解春艷*

（1廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊065000；2河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心，河北廊坊065000；3廊坊市微生物發酵研究重點實驗室，河北廊坊065000；4廊坊市食品營養與安全重點實驗室，河北廊坊065000）

秀珍菇Pleurotus geesteranus，是常見的食用菌之一，味道鮮美，蛋白質含量豐富，營養價值與牛奶相當，含有人體所需的8種必需氨基酸及多種礦質元素，營養價值極高[1-3]。秀珍菇屬于白腐真菌之一，吸收由自身分泌胞外酶裂解基質成小分子物質完成營養生長和生殖生長，即由胞外木質素酶及纖維素酶來分解基質中的木質纖維素作為自身所需的營養物質[4-7]。而秀珍菇菌絲分泌胞外酶的能力與培養基成分（如碳源、氮源、pH等）及培養周期有密切的關聯。

固態發酵是微生物在無游離水或游離水含量極低的環境中生長的過程。在這個過程中，固態基質可以看作是微生物整個生長代謝過程中營養和能量的來源，是微生物生長中必不可少的重要依存物質[8-9]。固態發酵對人類飲食的歷史重要性可以追溯到幾千年前，如西方國家的面包、奶酪制作及東方國家的酒曲。與液體發酵相比，固態發酵具有設備構造簡單、能耗低、易操作、污染少等特點。食用菌固態發酵經過多年的發展，在農業、食品、工業、環境、能源等有重要的應用價值[10-13]。秀珍菇為常見的食用菌之一，可以利用其菌絲胞外酶特性固態發酵谷物等糧食作物，提高谷物的營養價值，具有投資少、成本低、可大規模生產等優點，促進谷物的精深加工。

觀測秀珍菇菌絲的生長特性、胞外酶活性及菌絲生長周期等，探尋固態發酵前秀珍菇活化的最佳菌絲狀態，以期獲得最佳的秀珍菇活化培養條件，提高其各方面性能，促進固態發酵效率，為秀珍菇固態發酵谷物等糧食作物提供借鑒，也為其他食用菌固態發酵、理化性質的研究及新品種的選育提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試秀珍菇菌株080009，引自河北省食藥用菌資源高值利用技術創新中心。土豆購于廊坊元辰超市。其他試劑：酵母粉、蛋白胨、乳糖、蔗糖、硝酸銨、鹽酸、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、羥甲基纖維素鈉、二硝基水楊酸法（DNS）等均購自天津鼎國生物技術有限公司。

1.2 主要儀器設備

BPC-150生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；TD5A-WS低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHS-25-01型pH計，上海盛磁儀器有限公司；BAS224S賽多利斯電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）制造有限公司；DHG-9070鼓風干燥箱，中儀國科（北京）科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；L3L4物聯智能紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；OLB-2102C恒溫振蕩器，濟南敏創生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的制備

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，蒸 餾水1 000 mL，pH自然。

加富PDA培養基：PDA培養基中加入5 g/L蛋白胨。

無氮培養基：葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

無碳培養基：蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

液體培養基：上述固體培養基中去除瓊脂。所有培養基均經121℃20 min高溫高壓滅菌后使用。

1.3.2 菌絲培養及檢測

利用PDA平板培養基初步活化秀珍菇菌絲體，待菌絲長滿平板，挑選生長狀態良好的菌絲，用直徑0.8 cm打孔器制作菌餅，放入新的平板中央，于26℃恒溫生化培養箱中培養，每個條件4個重復。用十字交叉法每天固定時間測量菌落的直徑，同時觀察菌絲生長情況，直至菌絲長滿平板。

秀珍菇菌絲體活化后，用直徑0.8 cm打孔器制作菌餅，放入含100 mL液體培養基的錐形瓶中，每個錐形瓶放5塊菌餅，26℃150 r/min振蕩培養，3個重復。發酵結束后發酵液離心，取上清液測酶活，取沉淀的菌絲體烘干，稱重。

1.3.3 不同氮源對秀珍菇菌絲生長的影響

在無氮培養基中分別加入5 g/L的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀和酵母粉，以無氮培養基、PDA和加富PDA為對照。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態，初步確定氮源。

1.3.4 不同碳源對秀珍菇菌絲生長的影響

在無碳培養基中分別加入20 g/L的乳糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖，以無碳培養基為對照。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態，確定最佳碳源。

1.3.5 不同pH對秀珍菇菌絲生長的影響

加富PDA培養基用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調節其pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態，確定最佳pH。

1.3.6 木質纖維素降解相關的酶活性測定

1.3.6.1 纖維素酶活性測定

葡萄糖標曲的繪制：采用二硝基水楊酸法（DNS）測定葡萄糖含量[14-16]。在540 nm條件下測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度值，繪制葡萄糖標準曲線。

羧甲基纖維素酶活性測定：在試管中加入1.5 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液（0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液配制）[17]，加入0.5 mL粗酶液，50℃水浴30 min后，采用DNS法測定上清液中葡萄糖的含量，以煮沸滅活15 min的酶液做對照。每個樣品3次重復。

半纖維素酶活性測定：在試管中加入1.5 mL 0.5%的木聚糖溶液（0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液配制）[17]，加入0.5 mL粗酶液，50℃水浴30 min后，采用DNS法測定上清液中葡萄糖的含量，以煮沸滅活15 min的酶液做對照。每個樣品3次重復。

1.3.6.2 多酚氧化酶活性測定

采用鄰苯二酚法測定多酚氧化酶活性[18]。取1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.9），混勻，30℃水浴10 min，加入1 mL粗酶溶液，快速搖勻，以煮沸滅活15 min的酶液作為參比液，采用分光光度計于波長410 nm處測定溶液的吸光度。每30 s記錄1次，共測定3 min。以1 mL酶液，1 min內增加的吸光度表示酶活性的強弱。

1.3.6.3 愈創木酚酶活性測定

采用比色法測定愈創木酚酶活性[18]。取0.08 mol/L愈創木酚溶液0.5 mL，加入0.1 mL粗酶液，以沸水滅活粗酶液為對照，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6），混勻后490 nm處測定溶液的吸光度值，每30 s記錄1次。

1.3.6.4 漆酶活性測定

采用ABTS法測定漆酶活性[19]。1 mL粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L的ABTS緩沖液，反應3 min，分光光度計測410 nm波長處OD值。每30 s記錄1次，定義每分鐘使OD均值增加0.1所需的酶量為1個酶活力單位（U），計算酶活性。

1.3.6.5 淀粉酶活性測定

采用DNS法測定淀粉酶活性[20]。將0.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.6）和0.5 mL粗酶液混合，40℃水浴15 min，加入1 mL預熱的1%可溶性淀粉混勻，40℃水浴5 min后加入2 mL 0.4 mol/L NaOH混勻，取等量的混合液與DNS試劑混合定容，測吸光度值變化。

2 結果與分析

2.1 培養基氮源篩選

由圖1可知，固體培養基為PDA、加富PDA、蛋白胨和酵母粉時，菌落生長速度較快，但加富PDA菌落邊緣生長不整齊（表1），而氮源為硫酸銨、硝酸鉀及無氮源的培養基培養上，菌絲生長較慢，說明氮源影響菌絲的生長速度。此外，PDA培養基和加富PDA培養基中雖然菌絲生長速度較快，但是菌絲密度較密（表1），菌絲活力弱，而以蛋白胨和酵母粉為氮源時，菌絲生長速度快且菌絲濃密，活力強，第7天菌落直徑分別為8.07 cm和8.12 cm，兩者相差不大，因此，蛋白胨和酵母粉都有利于秀珍菇菌絲生長。

圖1 不同氮源培養基上秀珍菇菌絲菌落直徑

表1 不同氮源培養基上秀珍菇菌絲生長情況

2.2 培養基碳源篩選

從菌落直徑看，乳糖為碳源時菌落增長最緩慢，其他四種碳源的菌落增長都相對較快（圖2），然而菌絲的生長狀況卻有很大差異。由表2可知，淀粉和葡萄糖為碳源時，菌絲生長濃密，邊緣整齊，菌絲活力強，而碳源為麥芽糖和蔗糖時，菌絲密度一般，活力不如淀粉和葡萄糖的菌絲，乳糖為碳源的菌絲最差，菌絲稀疏。從第7天的菌落直徑看，淀粉或葡萄糖為碳源時菌落直徑分別為7.92 cm和8.69 cm，差距不是很大，綜合考慮最終確定碳源為葡萄糖。

圖2 不同碳源培養基上秀珍菇菌落直徑

表2 不同碳源培養基上秀珍菇菌絲生長情況

2.3 培養基p H篩選

由圖3可以看出，培養基呈堿性時，秀珍菇菌落直徑增長較快，但菌絲稀疏（表3）；呈弱酸性（pH6）或中性（pH7）時，菌絲生長潔白濃密，活力較強，pH自然值時，菌絲生長較密，優于堿性培養基。因此，培養基的pH以弱酸性或中性比較合適，具體pH數值還需要進一步篩選。

圖3 p H不同的培養基上秀珍菇菌落直徑

表3 p H不同的培養基上秀珍菇菌絲生長情況

2.4 培養基氮源最終篩選

根據固體培養基試驗結果，確定培養基碳源為葡萄糖，為進一步確定最佳氮源，進行液體培養比較，以菌絲體生物量、菌絲胞外酶活性為考察指標。

由圖4可知，相同液體培養（發酵）周期內，以蛋白胨為氮源的菌絲生物量為（5.42±0.14）g/L，而以酵母粉為氮源菌絲生物量為（7.70±0.10）g/L，且酵母粉為氮源時菌絲球更加均勻。

圖4 兩種氮源培養基中菌絲生物量

由圖5可知，兩種氮源的液體培養基培養秀珍菇菌絲的半纖維素酶、愈創木酚酶活性差異不大，而酵母粉為氮源的液體培養基培養秀珍菇菌絲的胞外羧甲基纖維素酶、多酚氧化酶、漆酶和淀粉酶酶活性稍高于氮源為蛋白胨。因此，氮源為酵母粉時培養秀珍菇效果最佳，菌絲生長濃密、長速較快，且胞外酶活性更強。

圖5 兩種氮源培養基中胞外酶活性

2.5 培養基p H最終篩選

培養基以葡萄糖為碳源，酵母粉為氮源，依據固體培養基試驗結果，分別調節液體培養基pH為5、6、7。

由圖6可知，當液體培養基pH為5、6、7時，秀珍菇菌絲生物量分別為（7.57±0.42）g/L、（9.34±0.22）g/L、（11.475±0.36）g/L，pH中性時菌絲生物量最高。由圖7可知，pH為7時，菌絲胞外酶活性相對較高，其次是pH為6，pH為5時，除羧甲基纖維素酶外，其他酶活性相對較低。因此，最終確定培養基的pH為7，此時的秀珍菇菌絲生長較好，活力強，且菌絲胞外酶活性較高。

圖6 不同p H的液體培養基中菌絲生物量

圖7 不同pH的液體培養基中菌絲胞外酶活性

2.6 秀珍菇菌絲培養周期篩選

秀珍菇液體培養周期也會影響其菌絲體的活力，培養周期短，菌絲生物量低，最終影響固態發酵周期，而培養周期太長，菌絲老化，活力下降，也會影響后期固體發酵效率。

由圖8可知，液體培養第4天開始，菌絲生物量隨著培養時間的延長，逐漸增多。由圖9可知，培養第6天，半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、愈創木酚酶活性最高，多酚氧化酶活性在第8天最高，淀粉酶活性第5天最高，此后一直下降。因此，秀珍菇培養周期6 d為佳，此時與木質纖維素降解相關的大部分酶活性最高，說明此時的菌絲活力最強。

圖8 不同培養周期菌絲生物量

圖9 不同培養周期菌絲胞外酶活性

3 小結

氮源、碳源、pH和培養周期都會影響秀珍菇菌絲體的活力，通過平板培養觀測菌絲體生長狀態，初步確定菌絲活化最佳碳源為葡萄糖，而氮源為蛋白胨和酵母粉時差異較小，且pH在弱酸性或中性條件下菌絲生長最佳。之后的液體培養進一步確定秀珍菇菌絲活化最佳氮源為酵母粉，碳源為葡萄糖，pH為7.0。通過菌絲體培養周期的生長曲線和菌絲胞外酶活性，最終確定發酵6 d時菌絲活力最佳，且菌絲胞外酶活性最強。

試驗明晰了秀珍菇菌絲活化最佳的碳源、氮源、pH和培養周期，為后期秀珍菇高效固體發酵提供保障，同時可為其他食用菌菌種選育、活化及理化性質的研究提供參考。