山東省栽培靈芝屬菌株的分子特征

蘭玉菲 孔 怡* 于清偉 馬為勇 崔 曉

（1泰安市農業科學院，山東泰安271000；2泰安市寧陽縣華豐鎮農技站，山東泰安271413）

靈芝屬Ganoderma真菌是重要的藥用真菌，隸屬于真菌界（Fungi），擔子菌門（Basidiomycota），傘菌亞門（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），在我國已有悠久的應用歷史[1]。

近年來山東省靈芝生產發展迅速，種質資源也在不斷豐富，但目前對靈芝屬種質資源的遺傳背景和遺傳多樣性缺少系統研究。因此，筆者對山東省栽培靈芝菌株的遺傳多樣性進行研究，明確了27個栽培靈芝屬菌株的分類地位，為靈芝屬種質資源保護、遺傳改良和新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試靈芝菌株

供試的27個靈芝菌株中ZL81來自四川中醫藥科學院，紫芝、園芝1號來自壽光食用菌研究所，其他24個菌株均來自泰安市農業科學院。具體編號見表1。

表1 試驗靈芝屬菌株及編號

1.2 主要試劑與儀器

真菌總DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等購自北京全式金生物技術有限公司；常規試劑為進口分裝或國產分析純。My Cycle PCR儀，美國伯樂儀器公司。

1.3 供試培養基

PDA加富培養基：配方參照文獻[2]。

1.4 菌絲體制備

切取保存在PDA加富斜面培養基上的菌絲純培養5 mm2，接種于PDA加富平板培養基中央，25℃暗培養5～7 d，待菌絲接近生長至平板邊緣后，刮取菌絲體用于基因組DNA的提取。

1.5 DNA的提取

利用DNA提取試劑盒提取真菌總DNA。具體步驟參照文獻[3]。提取的總DNA于-20℃保存備用。

1.6 ITS擴增

參照文獻[4]用于真菌ITS區域擴增的通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增。PCR反應體系和PCR反應程序參照文獻[3]。

表2 PCR擴增ITS所用引物的核苷酸序列

1.7 PCR產物測序

PCR擴增結束后，取4μL反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，將有目的條帶的PCR產物送山東省農業科學院生物技術研究中心測序。

1.8 構建系統發育樹

將所得DNA序列輸入GenBank進行Blast檢索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 6.06軟件對所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應序列進行比較和分析，并構建系統進化樹進行遺傳距離分析。

2 結果與分析

2.1 ITS擴增

以提取的27個靈芝菌株總DNA為模板，用真菌ITS區域擴增的通用引物ITS1/ITS4對其進行PCR擴增，獲得27個靈芝屬菌株的ITS序列，長度約為600 bp的目的片段，與預期片段大小一致。

圖1 部分靈芝菌株核糖體ITS區PCR擴增結果

2.2 ITS序列分析

測序獲得27個菌株的ITS序列片段，測得的菌株序列提交到GenBank并獲得登錄號（表3）。根據GenBank中已有靈芝屬菌株的ITS序列資料，確定ITS序列的ITS1、5.8S和ITS2的序列范圍。供試靈芝屬菌株的ITS序列的長度變異較大，G.lingzhisp.nov.ITS序列長度為542 bp，G.applanatumITS序列長度為560 bp，G.sienseITS序列長度為555 bp。

表3 27個靈芝屬菌株ITS序列的登錄號

2.3 聚類分析

根據MEGA6.06軟件中的Neighbour-Joining methods，以樟芝（Autrodia comphorata）作為外類群，對27個測得的和26個來自GenBank的ITS序列進行聚類分析，建立基于ITS序列的系統進化樹（圖2）。結果表明，山東省栽培靈芝菌株分布于3個聚類組（Ⅰ組、Ⅳ組和Ⅴ組）。Ⅰ組為G.lingzhisp.nov.，包括35個菌株，均來自東亞地區（其中2個菌株來自日本，其余菌株分別來自中國的遼寧省、河南省、安徽省、湖北省、廣東省、浙江省、四川省、山東省、福建省和江蘇省），23個供試菌株均聚于該組，為山東省主要栽培菌株，組內各菌株間核苷酸一致率在99.26%～100.00%。Ⅱ組為G.multipileum，包括3個菌株，均來自亞洲熱帶地區。Ⅲ組為G.lucidum，包括4個菌株，來自歐洲大陸。Ⅳ組為G.applanatum，包括5個菌株，供試菌株PCSS、FCSS和YXSS聚于該組，該組內菌株核苷酸一致率非常高，PCSS、YXSS與GenBank中的2個菌株（DQ425009、DQ424996）核苷酸一致率達100%，FCSS與其他4個菌株的核苷酸一致率為99.82%；Ⅴ組為G.siense，包括3個菌株，供試ZZ菌株聚于該組，與來自上海市（DQ424982）、福建省（HQ235633）的2個菌株核苷酸一致率分別為99.28%、99.64%。結果表明，利用ITS區能夠有效準確地將山東省栽培靈芝菌株分成G.lingzhisp.nov.、G.applanatum和G.siense三大類群，而與來自歐洲的G.lucidum親緣關系較遠，明確了山東省栽培靈芝菌株的分類地位。

圖2 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹

2.4 基于DNA序列的種間種內遺傳距離分析

根據MEGA6.06軟件構建的系統進化樹聚類情況，對所有菌株進行分組，計算種間種內遺傳距離。由表4可以看出，靈芝屬5個不同種種間遺傳距離的變化在0.039～0.101，表明他們之間的遺傳關系比較遠；而種內遺傳距離的變化在0.000～0.003，說明種內不同菌株間的遺傳距離都比較小，表明種內菌株之間的遺傳關系較近，并且遺傳進化過程中遺傳信息流動可能發生較頻繁。

表4 基于DNA序列的種間種內遺傳距離分析

3 小結

靈芝屬Ganoderma真菌為中國傳統的藥用真菌，具有扶正固本，提高機體免疫力等多種功能。靈芝因其突出的保健作用、不斷發現新藥用功效而成為科學家的研究熱點。然而靈芝屬的分類比較混亂，過去一直將來自東亞的靈芝“Lingzhi”歸為G.lucidum（起源于歐洲）。2012年，Cao等利用rDNA nuc-ITS，結合mt-SSU，RPB1，RPB2和TEF1-α對來自世界不同地區的靈芝菌株進行系統發育樹分析，明確“Lingzhi”的分類地位，并提出來自東亞的“Lingzhi”屬于一個新種G.lingzhi，同時進行形態學鑒別[5]。

筆者對獲得的27個ITS序列、26個來自GenBank的ITS序列進行聚類分析，建立基于ITS序列系統進化樹，結果表明，23個供試菌株均聚于G.lingzhi，其余4個菌株聚于G.applanatum和G.siense，結果與Cao等（2012）一致。

研究從DNA水平上對山東省栽培靈芝菌株的遺傳多樣性進行研究，明確了靈芝屬種質資源的親緣關系和分子特征，為靈芝屬種質資源遺傳改良、新品種的選育奠定分子基礎，同時為特異種質的鑒定提供了有效方法。