眼部感染休斯頓分枝桿菌1例報道

王晶晶， 蔣曉飛， 馬逸珉， 王 蓓

（復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040）

非結核分枝桿菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）是分枝桿菌屬（Mycobacterium）內除結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）復合群和麻風分枝桿菌（Mycobacterium leprosy）以外的其他分枝桿菌，大部分為腐物寄生菌，僅少部分可使人體致病[1]。休斯頓分枝桿菌（Mycobacterium houstonense）是屬于偶發分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum）的第3種生物變異復合體，是根據其表型和基因型數據定義的分枝桿菌基因型2分類的一個新的物種，與偶發分枝桿菌不存在抗藥性差異[2]。45%的偶發分枝桿菌臨床分離株第3種生物變異復合體和8種參考菌株分離自傷口，可引起皮膚及皮下軟組織病變[3]，其他菌株主要分離自呼吸道或血液樣本[2]。本文對1例休斯頓分枝桿菌感染病例進行報道。

1 病例資料

患者，男，46歲，30年前無明顯誘因突然出現雙眼視物發紅，當地醫院診斷為雙眼玻璃體出血，具體治療不詳，左眼視力一直較差。10年前，患者突發左眼疼痛，于當地醫院行左眼青光眼手術。2016年9月因眼壓控制不佳在復旦大學附屬華山醫院就診，行左眼閥門植入。2個月前左眼紅痛、閥門管自行掉落，在其他診所給予“克林霉素，1.2 g靜滴”，左眼脹痛無明顯好轉。復旦大學附屬華山醫院門診檢查示：右眼視力1.0，左眼視力無光感；右眼眼壓2.26 kpa（17.0 mmHg），左眼眼壓無法測出；左眼角膜水腫，前房積膿，左眼角膜后沉淀物（+++），丁達爾現象（+++），瞳孔圓，眼內結構不見。B超檢查示“左眼玻璃體混濁，炎癥？視神經萎縮？左眼軸長23.95 mm”。為進一步診治，擬“左眼眼內炎”收入院。2020年4月9日入院血常規檢查示：白細胞計數16.77×109/L。B超結果示“雙眼玻璃體混濁，左眼炎癥？視神經萎縮？左眼眼軸長約23.95 mm”（圖1）。2020年4月10日行左眼眼內容物剜除術，術中取玻璃體液培養，結果示：休斯頓分枝桿菌陽性，體外藥物敏感性試驗提示阿米卡星和左氧氟沙星敏感，予0.9%氯化鈉溶液100 mL+頭孢美唑2.0 g ivgtt q 12 h，5%葡萄糖氯化鈉注射液250 mL+阿米卡星0.6 g ivgtt qd，聯合左氧氟沙星0.5 g qd。出院囑左氧氟沙星（可樂必妥）0.5 g qd口服。隨訪40 d，眼部無不良異常表現。

圖1 影像學（B超）檢查結果

2 細菌培養鑒定與體外藥物敏感性分析

2.1 細菌培養

沿角膜緣無菌切開角膜，可見大量白色膿性物質溢出，抽取膿性物質分別注入需氧和分枝桿菌血培養瓶中送檢，1 d后需氧瓶和分枝桿菌培養瓶同時報陽。培養曲線顯示：分枝桿菌培養瓶[圖2（a）]、需氧培養瓶[圖2（b）]呈典型陽性生長曲線。取適量培養物分別轉種哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板和中國藍平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），置于5% CO2培養箱35 ℃培養，涂片2張，分別進行革蘭染色和抗酸染色（珠海貝索公司）。革蘭染色未見細菌，涂片抗酸染色見少量抗酸染色陽性菌。培養1 d后，血瓊脂平板[圖2（c）]和巧克力平板均有灰白色的細小菌落[圖2（d）]生長。第5天可見單個稍大菌落，血平板上呈黃白色大小不一凸起菌落，較干燥[圖2（e）]。同時將術中脫落組織行一般細菌培養，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養1 d，無細菌生長，第2天見灰白色的菌落[圖2（f）]，第5天見黃白色干燥菌落[圖2（g）]。挑取哥倫比亞血瓊脂平板上菌落行抗酸染色，可見抗酸染色陽性菌[圖2（h）]。

圖2 眼膿性物質血培養和一般細菌培養結果

2.2 質譜鑒定結果

用竹簽挑取血平板上純菌落，均勻涂到靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫環境放置，干燥后，再滴加1 μL基質液。室溫干燥后，用激光解吸電離飛行時間質譜儀（德國Bruker公司）進行分析。鑒定結果為鼻疽分枝桿菌，MALDI得分為2.054分（2.000為鑒定到種的閾值），見圖3。

2.3 測序結果

先采用聚合酶鏈反應擴增菌株的16S rRNA，引物為5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，預期產物長1 500 bp。產物采用正-反向測序，獲得1 384 bp準確的片段序列。序列做NCBI blast，結果為：Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium fortuitum（偶發分枝桿菌，一致性99.86%）等。由于16S rRNA區分不同種類分枝桿菌的效率不高，我們又采用聚合酶鏈反應擴增16S-23SrRNA間區，引物為5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'和5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'，預期產物長554 bp，擴增產物采用先克隆然后測序的方法，獲554 bp片段準確序列。序列做NCBI blast，結果為：Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性98.7%）最高，其次為Mycobacterium dioxanotrophicus（二氧化桿菌分枝桿菌，一致性87.79%），Mycobacterium fortuitum（偶發分枝桿菌，一致性88.09%）、Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性88.60%）。結合16S rRNA和16S-23S rRNA結果，確定為Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌）。

2.4 體外藥物敏感性試驗

參照文獻[5]推薦的可能敏感的抗菌藥物進行體外藥物敏感性試驗。用M-H血瓊脂平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司）進行紙片擴散法檢測，35 ℃培養2 d后，各藥物抑菌圈直徑結果分別為：阿米卡星34 mm、慶大霉素20 mm、利奈唑胺6 mm、復方磺胺甲噁唑6 mm、左氧氟沙星35 mm、亞胺培南29 mm、美羅培南19 mm、米諾環素10 mm、克林霉素6 mm、頭孢唑啉6 mm、頭孢呋辛6 mm、頭孢噻肟6 mm。參照美國臨床實驗室標準化協會M24-A文件[6]，采用快分枝桿菌微量肉湯藥物敏感性試驗程序及折點判讀結果，肉湯為7H9肉湯[艾禮生物科技（上海）有限公司]。將接種好的板條置于鋪有濕毛巾的白磁盆內，35 ℃培養，隔天觀察，保持濕度，培養第4天觀察到菌落顯著生長，讀取結果為：阿米卡星（2 μg/mL，敏感）、頭孢西丁（64 μg/mL，中介）、環丙沙星（0.25 μg/mL，敏感）、多西環素（≥32 μg/mL，耐藥）、復方磺胺甲噁唑（≥22 μg/mL/608 μg/mL，耐藥）、妥布霉素（≥32 μg/mL，耐藥）和左氧氟沙星（0.25 μg/mL，敏感）。

3 討論

本例患者于10年前行“左眼小梁切除術”，2016年9月行閥門管植入術，2個月前左眼內閥門管自行從眼內脫落，入院檢查示白細胞計數為16.77×109/L ，存在感染可能，4月10日左眼眼內容物剜除術中玻璃體液樣本培養出細菌，抗酸染色陽性，菌落形態似NTM，質譜鑒定結果示：前6位為鼻疽分枝桿菌，后2位為豬分枝桿菌。

進一步對該細菌行分子鑒定得到不同的結果：休斯頓分枝桿菌。回顧質譜鑒定結果，查找MALDI Biotyper3庫，該細菌庫中沒有休斯頓分枝桿菌。豬分枝桿菌與休斯頓分枝桿菌同為偶發分枝桿菌的第3種生物變異復合體[3]，參照此質譜鑒定結果，發現應用激光解吸電離飛行時間質譜對偶發分枝桿菌的第3種生物變異復合體這一類細菌的鑒定存在一定的局限性，質譜鑒定是對不同的蛋白峰進行分析，然后與庫中已有的已知蛋白峰做比對而得出的重合性的結果，在區分蛋白峰過于相似的細菌時精確性可能欠佳。測序作為鑒定的標準，采用16S-23S區間序列對該菌株進行分辨，一致性遠高于其他方法。所以對于此類分枝桿菌的鑒定，建議采用核酸測序的方法。

該病例為我國極少見的休斯頓分枝桿菌引起的眼部感染，最終經手術摘除病變的眼球，清潔感染部位，后續沒有更大范圍的感染。類似病例的早期診斷對患者的治療極其重要，懷疑感染可能的時候，可以考慮在普通培養鑒定的基礎上增加抗酸染色涂片和分枝桿菌培養等項目。實驗室在處理類似臨床樣本時，應盡可能地延長培養時間；在革蘭染色分辨細菌有疑問的情況下，可以考慮做抗酸染色，爭取更早、更準確地給予臨床結果。