Xpert MTB/RIF技術(shù)在高海拔地區(qū)結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

趙 穎， 嘎松卓嘎， 次 白， 劉治娟， 徐英春

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點實驗室，北京 100730；2. 西藏自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，西藏 拉薩 850000）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病，是目前世界上單一傳染源造成的主要死亡原因。MTB感染的早期、快速、準(zhǔn)確鑒定和藥物敏感性測定對于TB的治療和管理至關(guān)重要。我國是全球20個TB高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。而西藏地區(qū)是我國TB高負(fù)擔(dān)的地區(qū)之一，據(jù)統(tǒng)計，西藏自治區(qū)現(xiàn)有TB患者約80萬例，其中傳染性肺TB患者15 642 例，TB已成為導(dǎo)致西藏地區(qū)農(nóng)牧民群眾因病致貧、因病返貧的主要疾病之一[2]。目前，TB診斷主要依據(jù)胸部X線、抗酸染色鏡檢和細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果?？顾崛旧R檢敏感性差異較大，尤其在與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染的患者中。由于MTB生長緩慢，傳統(tǒng)的MTB培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗需要數(shù)周時間，不但影響臨床診療，而且易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療時間延長，治療成本增加，同時提高了發(fā)病率和病死率。鑒于上述原因，高海拔地區(qū)更亟需新的診斷方法來早期識別MTB，確定感染菌株的抗菌藥物敏感性。新的分子生物學(xué)方法具有更高敏感性和特異性，更好的早期檢測和檢測混合感染的性能。新型的分子檢測方法Xpert MTB/RIF技術(shù)采用實時熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，操作簡單，檢測快速[3-5]。本研究對西藏自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科開展Xpert MTB/RIF法檢測以來，對各類臨床樣本分枝桿菌檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，并與傳統(tǒng)的涂片抗酸染色鏡檢法結(jié)果進(jìn)行比較，探討Xpert MTB/RIF法在高海拔地區(qū)的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2016年6月—2018年10月西藏自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科同時行MTB Xpert MTB/RIF法檢測和涂片抗酸染色鏡檢患者的各類臨床樣本1 759例，包括痰液樣本1 531 例、 支氣管吸取物樣本104例、胸水樣本78例、中段尿樣本12例、腦脊液樣本11例、心包積液樣本11例、腹水樣本8例、肺泡灌洗液樣本2例、肺穿刺（右肺中間段纖維）活檢樣本 1例、膿液樣本1例。

1.2 試劑與儀器

美國Cepheid公司MTB rpoB基因和突變檢測試劑盒（實時熒光PCR法，Xpert MTB/RIF）及GXXVI-8型Gene Xpert檢測系統(tǒng)；金胺O熒光抗酸染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、萋尼抗酸染色試劑盒[歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司]，EURIStar Ⅲ Plus型熒光顯微鏡[歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司]，CX21型普通光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 方法

1.3.1 抗酸染色鏡檢 將臨床樣本涂片后，采用金胺O熒光抗酸染色鏡檢初篩，嚴(yán)格按照試劑說明書要求進(jìn)行染色，采用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，對于熒光染色形態(tài)可疑陽性樣本進(jìn)一步采用萋尼抗酸染色復(fù)染，采用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢確認(rèn)。按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]進(jìn)行操作和報告結(jié)果。

1.3.2 Xpert MTB/RIF法檢測 嚴(yán)格按照試劑說明書要求進(jìn)行操作。以內(nèi)對照探針即芽孢桿菌內(nèi)對照的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤38為陽性；以Ct值>38為無效，提示樣本提取核酸不合格或含有聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）抑制物。MTB陽性的診斷標(biāo)準(zhǔn)為 5個探針中至少有2個探針Ct值≤38，并可進(jìn)一步按照Ct值對樣本中的MTB進(jìn)行半定量分析：Ct值<16為高荷菌量，報告陽性（4+）；Ct值16～22為中等荷菌量，報告陽性（3+）；Ct值22～28為低荷菌量，報告陽性（2+）；Ct值28～38為極低荷菌量，報告陽性（1+）。 檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標(biāo)早期Ct值與晚期Ct值之差，即ΔCt值，系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：ΔCt>3.5提示對利福平耐藥，ΔCt≤3.5提示對利福平敏感。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

通過實驗室信息系統(tǒng)檢索每例患者同一時期送檢的抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法檢測結(jié)果，有1次結(jié)果為陽性即視為陽性。采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計2種方法的陽性率，比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法檢測結(jié)果

1 759例臨床樣本中，有100例（5.7%）抗酸染色鏡檢陽性，254例（14.4%）Xpert MTB/RIF法檢測陽性。Xpert MTB/RIF法陽性率高于涂片法（χ2=628.24，P<0.05），見表1。采用Xpert MTB/RIF法檢測到37例（2.1%）樣本中有利福平耐藥情況，見表2。100例抗酸染色鏡檢陽性樣本和1 659例陰性樣本中，Xpert MTB/RIF法分別檢出100例和154例陽性，Xpert MTB/RIF法與抗酸染色鏡檢結(jié)果不同陽性水平統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表1 1 759例樣本抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法檢測陽性率

表2 Xpert MTB/RIF法與抗酸染色鏡檢結(jié)果比較 例

表3 Xpert MTB/RIF法與抗酸染色鏡檢不同陽性水平結(jié)果 例

2.2 不同年齡、性別患者抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法檢測陽性率比較

18～24歲患者2種方法陽性率和利福平耐藥檢出率均居首位，其次是<18歲患者，見表4。男性和女性之間抗酸染色鏡檢陽性率、Xpert MTB/RIF法陽性率、利福平耐藥檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表4 不同年齡患者抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法陽性率比較 例（%）

表5 不同性別患者抗酸染色鏡檢和Xpert MTB/RIF法陽性率比較 例（%）

3 討論

TB是發(fā)病率和病死率均較高的傳染性疾病，目前控制TB的措施主要是通過早期診斷和及時治療來減少其傳播。TB的漏診或延遲診斷可能是災(zāi)難性的，會因感染時間的延長擴(kuò)大疾病傳播范圍，并增加患者醫(yī)療成本和病死率[7]。西藏地區(qū)是我國TB高負(fù)擔(dān)地區(qū)之一，且西藏地區(qū)TB的實驗室診斷相對較落后，各級醫(yī)院檢驗科普遍沒有條件開展MTB培養(yǎng)，絕大多數(shù)實驗室僅開展涂片抗酸染色檢測，又因為實驗室專業(yè)技術(shù)人員技術(shù)能力有限，水平參差不齊，因此20年來，西藏各級TB控制機(jī)構(gòu)共登記TB患者70 744 例，新發(fā)涂片陽性TB患者例數(shù)僅為17 845例[2]，不到登記數(shù)的1/3，多數(shù)患者確診仍然是依靠臨床診斷，缺乏病原學(xué)證據(jù)。

新型的分子檢測方法對于滿足TB快速診斷和及時治療的要求具有重要意義。Xpert MTB/RIF技術(shù)屬于全自動PCR檢測系統(tǒng)，具有操作簡便、檢測時間短、核酸污染率低、操作人員安全等優(yōu)點，已被世界衛(wèi)生組織推薦作為涂片陰性痰樣本和肺外TB的核酸擴(kuò)增檢測診斷方法。該技術(shù)對于實驗室人員和生物安全的要求均不高，并且其全封閉的檢測系統(tǒng)不受高海拔地區(qū)低氣壓的影響，適合在西藏等高海拔地區(qū)使用。本研究檢測的1 759例TB患者臨床樣本中，Xpert MTB/RIF法檢測陽性率為14.4%，高于抗酸染色鏡檢的陽性率（5.7%），與相關(guān)報道結(jié)果一致[3-5，8-9]，提示應(yīng)用該技術(shù)可以大大提高高海拔地區(qū)TB的實驗室診斷效率。

本研究1 759例患者中有9例為漢族，9例漢族患者中僅1例為2種方法檢測結(jié)果均為陽性，且利福平耐藥，因此未將漢族患者單獨分開統(tǒng)計。有研究發(fā)現(xiàn)，藏族人群TLR1基因存在與TB易感性相關(guān)的變異，而此變異不存在于漢族人群中[10]；IFNGR1基因突變體和IFNG基因多態(tài)性與藏族人群肺TB的易感性有十分密切的關(guān)系[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，藏族人群和漢族人群的肺TB易感因素有顯著差異，可能與西藏地區(qū)的特殊地理環(huán)境、人口分布，及其獨特的生活方式有關(guān)，如生活條件艱苦、較少攝入蔬菜、水果等[12]。因此，基于藏族人群和漢族人群的大樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計TB的發(fā)病率是否存在差異值得深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，18～24歲和<18歲患者抗酸染色鏡檢陽性率、Xpert MTB/RIF法陽性率和利福平耐藥檢出率均較其他年齡段患者高，提示西藏地區(qū)該年齡段人群發(fā)病率較高，這與2018年世界衛(wèi)生組織全球TB報告[1]中顯示的中國>65歲人群發(fā)病率最高有所不同，其原因有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，男性和女性之間2種方法陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與印度地區(qū)聚居藏族人群中TB的篩查結(jié)果一致[4，13]。本研究1 759例患者中有37例（2.1%）檢出對利福平耐藥，與文獻(xiàn)報道[5，9]一致。

綜上所述，在西藏等高海拔地區(qū)，對于高度懷疑活動性TB的患者，建議采用Xpert MTB/RIF法檢測，以盡早確診，并開展抗TB治療，從而減少疾病傳播，降低病死率，改善患者生活質(zhì)量。在西藏地區(qū)推廣該技術(shù)，可更好地為臨床早期診斷TB和指導(dǎo)用藥提供實驗室依據(jù)。