Xpert MTB/RIF技術在不同類型淋巴結結核中的診斷價值

張國英， 何 芳， 夏 廈， 郭一迪， 徐衛平， 黃子慧

（南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院檢驗科，江蘇 南京 210014）

淋巴結結核是因淋巴結被結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的一類肺外結核病[1]，在肺外結核中最為多見，占30%～40%[2-3]。臨床上按其病變部位分為頸部淋巴結結核、腋窩淋巴結結核和腹股溝淋巴結結核，其中最為多見的是頸部淋巴結結核，占淋巴結結核的80%～90%[4]；按病理學分型，淋巴結結核分為干酪樣型、增殖型和混合型[5]。日常診斷中，常因其受累部位較廣與其他淋巴系統疾病相混淆[6]，導致誤診或漏診，也給淋巴結結核的早期診斷帶來了一定困難。

Xpert MTB/RIF技術是由美國Cepheid公司研發的一項基于MTB核酸擴增的全自動熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，可同時快速檢測樣本中的MTB，及其是否對利福平耐藥，所需時間僅約2 h，且臨床樣本不需進行核酸提取等預處理，生物安全性高。目前，該技術已被廣泛用于肺結核的診斷[7-8]，但在淋巴結結核這類肺外結核中的應用較少，針對不同類型淋巴結結核的研究則更罕見。本研究應用Xpert MTB/RIF技術對臨床已確診的不同類型淋巴結結核患者的樣本進行檢測，并與抗酸染色和γ干擾素釋放試驗（gammainterferon release assay，IGRA）等MTB常用實驗室檢測技術進行比較，以評價其在不同類型淋巴結結核中的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2018年12月南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院淋巴結結核患者235例（淋巴結結核組），其中男92例、女143例，年齡（44.6±17.6）歲，均經細針穿刺細胞學或對手術切除的病理組織進行病理學檢查后確診；按病變部位分為頸部淋巴結結核（172例）、腋窩淋巴結結核（51例）、腹股溝淋巴結結核（12例）；按病理學分型分為干酪樣型（36例）、增殖型（41例）、混合型（158例）。另選取南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院非結核性淋巴結病變患者81例（對照組），其中男29例、女52例，年齡（39.6±16.5）歲，包括結節病患者13例、非結核淋巴結炎患者37例、惡性淋巴瘤患者21例、淋巴結轉移癌患者10例，均經相關檢查排除結核病。

1.2 儀器和試劑

Xpert MTB/RIF熒光定量PCR儀（美國Cepheid公司）及配套試劑。EVOLIS全自動酶免疫分析儀（美國伯樂公司）。IGRA定量檢測試劑盒（北京萬泰生物藥業有限公司）。BSZGT116型全自動染色儀及其配套試劑（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本處理 （1）淋巴結組織樣本。取患者手術時切除的淋巴結組織2～3枚，每枚黃豆大小，加入2.0 mL磷酸鹽緩沖液，于無菌研缽中研磨后，獲得均質混懸液，取0.7 mL混懸液置于無菌前處理管中，再加入1.4 mL樣本處理液。（2）膿液。取1.0 mL膿液加入2.0 mL樣本處理液，漩渦震蕩獲得混懸液。

1.3.2 抗酸染色鏡檢 取患者膿液或痰樣本中干酪樣、膿樣等可疑部分約0.05 mL，于載玻片上均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形薄膜，自然干燥，染色前加熱固定。亦可取5～10 μm厚、石蠟包埋的淋巴結組織切片進行染色。染色時，按儀器操作指導書要求將預處理好的玻片放置于染色儀上進行萋尼二氏染色，約10 min后染色完畢。以肉眼觀察到樣本區為亮藍色、無紅色斑塊染色為合格。鏡檢時，于100×油鏡下觀察，淡藍色背景下可見染成紅色的細長或略帶彎曲的桿菌，有分枝生長趨向，即為抗酸陽性桿菌；其他細菌或細胞被染成藍色。

1.3.3 IGRA 采集患者清晨空腹靜脈血5.0 mL，肝素抗凝，充分混勻后，分裝于本底對照、陰性對照和測試管中，每管1.0 mL，37 ℃恒溫培養（2 2±2）h后，2 0 9 5×g離心10 min，取上清液進行檢測。嚴格按照說明書要求進行操作。

1.3.4 Xpert MTB/RIF檢測 在樣本處理管中分別加入0.7 mL處理后的淋巴結組織混懸液和1.4 mL樣本處理液或1.0 mL膿液+2.0 mL樣本處理液，旋緊蓋子，渦旋振蕩10 s，室溫孵育10 min，再渦旋振蕩10 s，室溫孵育5 min，用移液管吸取2.0 mL處理后的樣本，加入試劑盒中，再置于檢測模塊中進行檢測，2 h后系統可自動讀出檢測結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淋巴結結核組和對照組Xpert MTB/RIF檢測的陽性檢出率比較

235例淋巴結結核患者中，Xpert MTB/RIF檢出199例，陽性檢出率為84.7%；對照組陽性檢出率為0。2組陽性檢出率比較，差異有統計學意義（P<0.001）。

2.2 Xpert MTB/RIF、抗酸染色、IGRA檢測效能比較

235例淋巴結結核患者中，Xpert MTB/RIF檢出199例，敏感性為84.7%；IGRA檢出215例，敏感性為91.5%；抗酸染色僅檢出18例，敏感性為7.7%。Xpert MTB/RIF的敏感性高于抗酸染色（P<0.001），但低于IGRA（P<0.001）。81例非淋巴結結核患者中，Xpert MTB/RIF和抗酸染色均未檢出陽性病例，特異性均為100%；IGRA檢出16例陽性病例，特異性為80.2%，低于Xpert MTB/RIF和抗酸染色（P<0.001）。見表1。

表1 3種方法檢測淋巴結結核的敏感性、特異性和陽性預測值、陰性預測值 %（例/例）

2.3 Xpert MTB/RIF在不同類型淋巴結結核患者中的陽性檢出率比較

Xpert MTB/RIF在頸部淋巴結結核、腋窩淋巴結結核和腹股溝淋巴結結核患者中的陽性檢出率分別為83.7%（144/172）、90.2%（46/51）和75.0%（9/12），但差異無統計學意義（P>0.05）。Xpert MTB/RIF在干酪樣型、增殖型和混合型淋巴結結核患者中的陽性檢出率分別為91.7%（33/36）、78.0%（32/41）和84.8%（134/158），差異亦無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

目前，淋巴結結核的實驗室診斷方法主要有傳統的涂片抗酸染色、結核抗體檢測和分枝桿菌培養等。但因淋巴結結核的組織樣本和患者痰液中帶菌量少[9]，而膿液樣本不易獲取，導致抗酸染色陽性率不高，限制了其在臨床上的應用。本研究中，抗酸染色鏡檢的陽性檢出率（敏感性）僅為7.7%。培養法雖是金標準，但也因所需時間長，陽性率低等原因，無法滿足臨床診療的需求。近年來，基于細胞免疫反應的IGRA逐漸被推廣使用，該方法主要是將待檢患者的全血樣本和MTB特異性抗原EAST-6、CFP10在體外進行共培養，患者樣本中結核抗原特異性T細胞被EAST-6和CFP10刺激后產生免疫應答，分泌γ干擾素，通過測定γ干擾素的濃度來判斷患者體內是否有針對MTB的T細胞免疫反應，從而判斷患者是否感染[1]。IGRA的特異性和敏感性均較高[6，10]。本研究中，IGRA的敏感性和特異性分別為91.5%和80.2%，也證實了這一點。但其不足之處在于，IGRA需24 h才能出結果，且難以區分活動性結核和潛伏性結核，并存在一定的假陽性。

Xpert MTB/RIF采用半巢式熒光定量PCR技術，通過檢測MTB所特有的rpo B基因及其耐藥突變，來判斷樣本中是否含有MTB復合菌DNA，以及利福平耐藥基因是否突變，自2013年被世界衛生組織推薦用于結核病的診斷以來，對其在結核病中的應用價值，一直被學者們所關注。目前，國內外相關報道主要集中在肺結核領域，多項研究均認為其用于肺結核的快速診斷，有很好的檢測性能[11-12]，而對其在肺外結核病，尤其是淋巴結結核病中的作用的報道相對較少。TADESSE等[13]以培養或涂片結果為金標準，發現Xpert MTB/RIF在淋巴結結核病中的診斷敏感性為 87.8% ，特異性為91.1%。楊澄清等[14]發現，Xpert MTB/RIF檢測頸部淋巴結核病的敏感性為74.38%。周林等[6]發現Xpert MTB/RIF檢測淋巴結核病的敏感性為96.1%，特異性為100%。本研究中，Xpert MTB/RIF技術的檢測敏感性為84.7%，與TADESSE等[13]的報道一致，但稍高于楊澄清等的報道，略低于周林等[6]的報道，可能與采樣及所選病例不同有關。樣本中MTB的帶菌量較少，或納入患者前期經過抗結核治療等，都有可能導致假陰性結果。本研究中，Xpert MTB/RIF檢測的特異性為100%，與周林等[6]的研究結果一致，略高于TADESSE等[13]的研究結果，可能與研究時采用的金標準不同有關。

本研究中，與抗酸染色和IGRA相比，Xpert MTB/RIF的敏感性顯著高于抗酸染色（P<0.001），略低于IGRA（P<0.001），可能與該技術只需樣本中存在少量的 MTB DNA，且不需活菌或完整的菌體有關；特異性雖與抗酸染色一致，但比IGRA高（P<0.001），提示Xpert MTB/RIF檢測受患者自身的免疫狀況影響較小；Xpert MTB/RIF只需2 h即可出結果，且操作簡單，對實驗室生物防護要求不高，又不需要特殊的PCR實驗室，便于開展。可見，Xpert MTB/RIF是一項比較適合臨床實驗室開展的技術。

本研究對Xpert MTB/RIF在不同類型淋巴結結核中的診斷價值的研究結果顯示，干酪樣型陽性檢出率為91.7%，稍高于增殖型和混合型，但3種類型差異無統計學意義（P>0.05）；腋窩淋巴結結核的陽性檢出率稍高，為90.2%，但與頸部淋巴結結核和腹股溝淋巴結結核相比，差異也無統計學意義（P>0.05）。淋巴結結核可發生于全身各處淋巴結，如腸系膜淋巴結結核，本研究中，因這類淋巴結結核的臨床病例較少，故分析時暫未納入，其具體差異還有待今后進一步探討。

綜上所述，Xpert MTB/RIF技術對淋巴結結核的診斷具有較高的價值，敏感性高、特異性好，且操作簡單、快速，不需單獨提取核酸，生物危害小，對臨床常見的不同類型淋巴結結核均有較好的診斷價值。隨著淋巴結結核發病率的不斷上升，臨床宜不斷推廣該技術的應用，以進一步提高早診率和確診率。